第三次醫學革命

iPSC
 

細胞療法是近年來醫藥研發中發展非常迅速的一個領域，其主要的治療方式為免疫細胞治療和干細胞治療。干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，根據不同的分化潛能分類可分為全能干細胞、多能干細胞、單能干細胞，其具有多向分化潛能、無限地分裂、增殖等特性。
誘導多能干細胞（iPSC）治療技術被譽為是繼藥物治療和手術治療之后的第三次醫學革命，是近年來國際醫學前沿重點發展領域，為整個干細胞生物學領域和臨床再生醫學提供了新的研究方向。

01  iPSC的定義
 

誘導多能干細胞(iPSC)，又稱人工誘導多能干細胞，是將一系列誘導因子導入到成熟體細胞中，并重編程為具有類似胚胎干細胞特征的一種多能干細胞。
iPSC可以通過CRISPR/Cas9基因編輯產生同基因對照細胞系，在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞極為相似，具備和胚胎干細胞一樣的應用潛能。
 

02   iPSC的優勢

iPSC的致瘤系數遠低于胚胎干細胞和間充質干細胞。
iPSC可以由成體細胞直接誘導而成，打破了干細胞研究中不可回避的倫理道德和免疫排斥等局限，為干細胞的臨床應用和研究提供了一個全新視角。
iPSC與其他來源于人體的干細胞一樣，具有超強的分化再生能力、且免疫原性低。在再生醫學、篩選和開發新藥領域應用廣泛。
由患者自身的細胞誘導獲得，因此極大地解決了潛在的免疫排斥問題。

03   iPSC的應用

再生醫學：
iPSC具有超強的分化能力，在特定條件下，可誘導分化成人體所需的不同類型的細胞，甚至類器官；
疾病建模：
由于iPSC固有的自我更新特性和分化為體內幾乎任何細胞類型的潛力，患者特有的iPSC可以提供大量與疾病相關的細胞和以前無法獲得的各種不同類型的細胞（如神經元和心肌細胞），實現個性化的疾病建模，這將成為精準醫學的核心部分；
新藥研發：
研究人員可以使用培養的干細胞來測試藥物的效用，了解藥物治療的可能性，這對研究人員新藥研發的助力是不可預估的。

疾病及衰老患者，通過iPSC再生醫學管理誘導多能干細胞，用介入方式注入誘導多能干細胞使細胞器官功能恢復

04   iPSC培養指南

劃重點：
1.iPSC培養過程中不建議使用抗生素，抗生素會影響細胞的活性和分化潛能。
2.iPSC培養環境應與其它細胞隔離，兩次傳代后檢測支原體。

01基質膠用于多孔板的包被：
（1）將Gelnest™基質膠(干細胞專用)置于冰中并在4℃融化，使用預冷的移液管或吸頭混合基質膠至均勻狀態。

注：GelNest™基質膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多種多種生長因子。這些成分可以提供細胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號，模擬生理環境中基底膜的特性，從而進一步模擬生理環境中的細胞信號通路和互動，提高細胞培養的成功率和效果。

（2）在冰上，將基質膠與DMEM培養液按照1:80或1:100的比例混勻，例如取1mL基質膠加入80mL或100mL DMEM培養液中，使用預冷的移液管混合至均勻狀態。

注：可根據實驗具體情況調整稀釋比例。

（3）將6孔板置于冰上，按照每孔1mL向6孔板中加入稀釋后的基質膠。
 

（4）將6孔板置于37℃孵育過夜。
注：一般情況下，孵育1小時即可使用，但過夜孵育的細胞培養效果更好。
（5）使用前吸出未結合的基質膠。
注：需確保移液管的尖端不會刮傷涂層表面。

02 Y-27632 （ROCK抑制劑）溶液的配制
將Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注：Y-27632的工作濃度為10µM。

03配制含Y-27632的人胚胎干細胞培養液（如mTeSR™1或TeSR™-E8™）
取Y-27632溶液與mTeSR™1培養液按照1:1000的比例混勻，例如取10µl Y-27632溶液加入10mL mTeSR™1培養液中，即得10mL含10µM Y-27632的mTeSR™1培養液。

04 iPSC復蘇：
（1）將凍存的iPSC置于37℃水浴迅速解凍，將細胞溶液轉移至離心管中，用DMEM培養液沖洗凍存管兩次并轉移至離心管中，與管中細胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（2）棄上清，用2mL含Y-27632的mTeSR™1培養液重懸iPSC，隨后將細胞懸液轉移至基質膠包被好的6孔板的1個孔中，置于培養箱中培養。
注：建議將每支復蘇的細胞(約100萬個)轉移至6孔板的1個孔中培養使細胞存活率最大化。
（3）第二天對iPSC進行換液，將含Y-27632的mTeSR™1培養液更換為不含Y-27632的mTeSR™1培養液。

注：可使用耐思新推出細胞復蘇儀替代原始細胞復蘇過程，細胞復蘇時間短，細胞存活率高。
 

05 iPSC傳代：

注：iPSC細胞生長至單層后會迅速分化并死亡，為保持其活性和多能性，需在長滿前進行傳代。

（1）去上清，用1mL PBS洗滌1次，加入1mL適當的細胞消化液
（2）將培養板轉移至培養箱中孵育3分鐘。顯微鏡下觀察，大部分細胞脫落，若細胞仍附著，可以用手輕輕拍打培養板底部使細胞脫落。
（3）將消化下來的細胞轉移至離心管中，用DMEM培養液洗滌培養板表面兩次并轉移至離心管中，與管中的細胞合并，室溫300×g離心5分鐘。
（4）棄上清，用含Y-27632的mTeSR™1培養液進行重懸，隨后將細胞懸液轉移至基質膠包被好的6孔板中，置于培養箱中培養。

06iPSC凍存：

NEST生物樣本庫系列含有全規格細胞凍存管及凍存液，操作簡單，安全無菌。
 

（2）參考細胞凍存液的相關步驟進行細胞消化。（點擊閱讀原文獲取凍存液使用指南）
（3）計數，棄上清，加入適量凍存液，以每管1mL凍存液（約100萬個細胞）分裝至凍存管中。
（4）將細胞凍存管放置于可逐步降低溫度的NEST程序降溫盒內并放置在-80℃冰箱內，確保冷卻速度約為1℃/分鐘。通常冷卻速度不宜快于0.5℃/分鐘。
（5）放置在-80℃冰箱內約24小時后轉移至液氮氣相中保存。
 

iPS細胞的成功誘導給細胞治療及再生醫學研究開辟了全新的道路。相信在不久的將來，iPSC技術能快速突破瓶頸，NEST也將持續研發新品，推動再生醫學的蓬勃發展，為患者帶來新生的希望！

05 NEST基質膠選用指南