靶向重測序技術原理及基因組學研究中的應用
1.1 靶向重測序技術的定義和原理
在介紹靶向重測序之前，我們先了解一下全基因組測序(WGS)。全基因組測序（WGS, Whole Genome Sequencing）是下一代測序技術，用于快速，低成本地確定生物體的完整基因組序列。其目的是準確檢測出每個樣本（這里特指人）基因組中的變異集合，也就是人與人之間存在差異的那些DNA序列。即是對生物體整個基因組序列進行測序，可以獲得完整的基因組信息。
NGS技術正逐年成熟，這使得全基因組測序的成本越來越低，但是對全基因組進行測序后得到的極其龐大、繁雜的數據量的分析工作并沒有隨之一起變得更加簡單。相反，測序技術的發展出現了兩個極端的方向：一種是大而全的全基因組測序，一種是小而精的靶向重測序。
相比于全基因組測序（WGS），靶向重測序即將一組基因或基因組區域分離出來并對其進行測序。使用新一代測序（NGS）的靶向方法讓研究人員能夠將時間、費用和數據分析集中在感興趣的特定區域。這種靶向分析包括外顯子組（基因組的蛋白質編碼部分）、感興趣的特定基因、以及基因或線粒體DNA中的目標。
靶向測序將感興趣的基因組區域通過捕獲試劑盒進行富集后測序，利用較少的數據量就能得到超高的靈敏度和準確度，實現變異位點的快速篩選。相較全基因組測序和全外顯子測序，靶向測序能夠聚焦所關注的區域，去除冗余數據的干擾，同時最大限度地利用測序reads，測序成本低且測序深度深，尤其適用于在臨床應用中樣本量少時的選擇。
靶向測序的方法主要分為多重擴增子測序和雜交捕獲測序兩條技術路線。多重擴增子測序即針對感興趣的目標區域，設計多重PCR引物進行擴增富集并進行測序的技術。通常適用于檢測幾十到幾千個位點，或幾十kb以下的區域。
1、設計多重 PCR 引物，從基因組 DNA 中擴增目標區域序列
2、優化多重 PCR 反應，使目標區域能夠均勻覆蓋
3、擴增目標區域，加測序接頭，不同樣本加上不同 index 區分
4、利用高通量測序平臺對目標區域進行深度測序
雜交捕獲測序，目前應用的主要是液相雜交捕獲測序，即基于堿基互補配對原理，設計合成核酸探針，對DNA文庫進行基于液相環境的目標區域雜交富集，并進行測序。液相雜交捕獲測序可適用于幾kb到上百Mb的基因組目標區域的檢測，可檢測SNV，InDel，CNV，SV，基因融合等變異。
| 液相雜交捕獲 | 擴增子測序 | |
| 富集策略 | 探針雜交 | 多重PCR |
| 核酸片段長度 | 打斷為500bp左右 | 無要求 |
| 目標區域總長 | >100K | <1000K |
| 檢測變異類型 | SNP、大片段Indels、融合基因、擴增等 | SNP、小片段Indels、擴增等 |
| 特異性 | 70%左右 | 95%以上 |
| 樣本起始量 | 200ng | 10ng |
| 操作時間 | 全程12h，手工操作4h | 全程4h，手工操作5min |
| 探針/引物花費 | 多 | 少 |
| 樣本平均花費 | 總樣本量>20，花費較少總樣本量<20，花費較多 | 較少 |
| 操作難度 | 較高 | 低 |
| 適用范圍 | 發現更多新的從未報道過的SNP、融合基因、大片段Indels等 | 發現更低頻（低于0.1%）的突變，適用于ctDNA的研究 |
| 制約因素 | 探針捕獲效率 | Panel擴增均一性 |
1.2 靶向重測序技術服務流程
二、靶向重測序技術在基因組學研究中的應用
2.1 靶向重測序技術在單基因遺傳病研究中的應用
單基因遺傳病是指由單個基因變異所導致的疾病，這些變異可能包括基因突變、基因拷貝數變異等。靶向重測序技術可以對與單基因遺傳病相關的基因或基因組區域進行深度測序，從而檢測出可能導致疾病的變異。
例如，在囊性纖維化（Cystic Fibrosis）研究中，靶向重測序技術被用于檢測CFTR基因的變異。CFTR基因是一種編碼氯離子通道的基因，其變異可能導致囊性纖維化的發生。通過靶向重測序技術，可以快速檢測出CFTR基因的變異，為診斷和治療方法的選擇提供依據。
此外，靶向重測序技術還可以用于檢測基因多態性，即不同個體之間存在的基因變異。這些多態性可能對個體的表型特征產生影響，如對藥物的反應、疾病易感性等。通過對這些多態性的檢測，可以為疾病的預防、診斷和治療提供指導。
2.2 靶向重測序技術在復雜疾病研究中的應用
復雜疾病是指由多基因和環境因素共同作用導致的疾病，如糖尿病、心血管疾病、癌癥等。靶向重測序技術可以在全基因組范圍內篩選出與復雜疾病相關的變異位點，從而為復雜疾病的研究提供更深入的見解。
例如，在糖尿病的研究中，靶向重測序技術可以針對與胰島素分泌和敏感性相關的基因進行深度測序，從而檢測出可能導致糖尿病的變異。通過對這些變異的檢測和分析，可以為糖尿病的診斷、治療和預防提供依據。
2.3 靶向重測序技術在癌癥基因組學研究中的應用
對癌癥組織基因測序，可以了解癌癥組織的基因變異情況，為癌癥的診斷和分類提供依據。例如，在肺癌研究中，靶向重測序技術可以針對與肺癌發生相關的基因或基因組區域進行深度測序，從而檢測出可能導致肺癌的變異。通過對這些變異的檢測和分析，可以為肺癌的診斷、治療和預防提供依據。
三、靶向重測序技術的優勢
3.1 高特異性：靶向重測序技術針對所關注的區域進行測序，能夠去除冗余數據的干擾，最大限度地利用測序reads，從而得到更準確的結果。
3.2 高測序深度：靶向重測序技術可實現深度測序，能夠檢測出低頻變異，提高了檢測的靈敏度和準確度。
3.3 高效經濟：靶向重測序技術所需的樣本量較少，測序成本低，適用于在臨床應用中樣本量少時的選擇。
3.4 高通量：靶向重測序技術可以同時對多個目標區域進行測序，提高了測序的效率。
四、總結
4.1 總結靶向重測序技術的價值和意義
靶向重測序技術是一種高效經濟的基因測序方法，具有高特異性和測序深度，廣泛應用于臨床實踐和基因組學研究。它可以幫助我們更好地理解疾病的病因、病理和病程，為疾病的診斷、治療和預防提供依據，同時也可以發現新的基因變異和物種演化信息，為生物科學和醫學研究提供更多的數據支持。
4.2 靶向重測序技術的發展方向和應用前景
首先，靶向重測序技術的特異性、測序深度和覆蓋范圍等性能將得到進一步提升。
其次，靶向重測序技術將更多地應用于復雜疾病的研究中。目前，靶向重測序技術已經在單基因遺傳病研究中得到了廣泛應用，靶向重測序技術可以通過對全基因組的深度測序，篩選出與復雜疾病相關的變異位點，為復雜疾病的研究提供更深入的見解。
最后，靶向重測序技術可以與其它基因組學技術（如全基因組測序、轉錄組測序等）相結合，形成更為綜合的解決方案，從而更好地解析生物過程的復雜性。
