外泌體是一種細胞分泌的微小膜泡，大小為30~150nm的磷脂雙分子結構，可在細胞間傳遞物質和信號。它在機體內廣泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、腦脊液等各種體液中。

外泌體攜帶有多種蛋白質、脂類、DNA和RNA等重要信息，不僅在細胞與細胞間的物質和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標志物。

但外泌體所存在的體液環境復雜，在尺寸、形態和生化特性等方面又存在著較大的差異，因此如何能有效地分離出外泌體以供進一步研究一直是該領域的難題。

本篇跟大家簡單介紹一下，外泌體提取與純化過程中常用到的一些方法，以及各種方法的特點。
 

六大提取與純化法

1、差速離心法
 

差速離心法是最常見的外泌體分離技術之一。這種方法利用外泌體與其他細胞器的沉降系數不同，將細胞、細胞碎片以及其他細胞器等，通過不同離心速度分離出去，從而得到純凈的外泌體。

優點：提取方法簡單，提取過程中不會引入其他的標記物，適合大劑量的樣品處理。

缺點：操作繁瑣，費時費力，操作過程中需要超高速離心，且由于離心力的因素，可能會導致外泌體結構破壞從而對下游實驗造成影響，對于一些具有高粘度的生物樣品（例如血漿和血清樣本），則需要更長的超速離心步驟和更高的離心速度。

2、密度梯度離心法
 

該方法將超速離心與蔗糖密度梯度相結合，利用外泌體1.13g/ml-1.21g/ml的密度范圍，實現外泌體與非囊泡顆粒（如蛋白質、蛋白質/RNA聚集體等）進行分離，從而能夠提取含量低的外泌體。

2018年Li K等人改良了此方案，使用碘克沙醇作為新的一種高效介質，外泌體回收率更高、純度更高，并且結構和功能保持更好。

3、聚合物沉降法
 

這種方法是通過高分子的疏水聚合物（如聚乙二醇（PEG））可以改變外泌體溶解性和分散性的特點，使其能夠在比較低的離心力下沉降出來。其原理可能與疏水聚合物競爭性結合游離水分子以及疏水聚合物本身形成的網狀結構有關。

優點：操作起來較為簡單，不需要超速離心機，得到的外泌體數量較多，對外泌體理化性質影響較小。

缺點：基于聚合物的沉淀方法可能會同時分離非囊泡污染物（如脂蛋白等），從而對下游分析造成一定影響。

4、超濾法
 

這種方法是將溶劑及小分子物質過濾到膜的另一側，而將相對大分子物質截留在超濾膜上，以達到分離的目的。外泌體直徑范圍30～150 nm，利用超濾膜經過長時間的低速離心就可以分離樣本中的外泌體。

優點：操作方便，富集效率比較高，易于搭配其他膜或操作，并且成本較低。

缺點：過膜易損耗變形，導致膜堵塞，純度較低，大顆粒蛋白污染嚴重，并且在洗脫過程中，附著于膜上的外泌體難以回收，導致提取損失。

5、磁珠特異性捕獲法
 

磁珠特異性捕獲法外泌體表面帶有許多特殊的膜蛋白，如CD9、CD63、CD81等，可將這些外泌體標志蛋白作為分離外泌體的特異性標記。通過將抗體固定于磁珠等基質上，利用抗體與這些標志蛋白之間的特異性相互作用，從而得以實現對外泌體的特異性富集。

優點：獲得的外泌體純度較高，并且外泌體膜結構不受太大影響。最近的一項研究已應用免疫親和超順磁性納米粒子（ISPN）來結合外泌體，研究人員通過連接抗CD63抗體和納米粒子生成ISPN，并用它們從體液中分離外泌體。

6、尺寸排阻色譜法
 

這種方法利用多孔的凝膠球，通過分子大小不同將外泌體純化出來。在分離提取過程中，大分子物質不能進入凝膠孔，很快沿多孔凝膠間的縫隙被流動相洗脫出來，而小分子物質能進入凝膠孔，滯留時間更長，會更慢地被洗脫出來。外泌體的分子粒徑大于一般的蛋白分子，所以外泌體會先被洗脫下來，而粒徑小的蛋白質會被后洗脫下來，從而分離出高純度的外泌體。

優點：獲得的外泌體純度相對較高，且外泌體結構不易受到破壞。