mRNA 疫苗的設計與合成原理及作用機制
mRNA 疫苗是在體外轉錄好的一段編碼抗原蛋白的完整 mRNA，包含 5 部分：① 5’ 帽子結構，② 5’ 非編碼區 (untranslated region, UTR)，③ 一個編碼抗原的開放閱讀框(open reading frame, ORF)， ④ 3’ 非編碼區，⑤ 3’ poly (A) 尾 (圖 1)[1]。
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(1) 5’ 帽子結構包含一個 7-甲基鳥苷 (m7G)，通過三磷酸橋連接到 mRNA 的5’端。5’ 端第y個或第二個核苷酸在核糖的 2’ 羥基上被甲基化 (2’ - O- methylation)，這阻止了 RNA 被細胞識別，從而阻止了非預期的免疫反應。此外，5’ 帽子結構在空間上保護 mRNA 不被外切酶降解。
(2) 在 3’ 端，poly(A) 尾的長度間接調控 mRNA 的翻譯和半衰期。一個足夠長的尾巴 (100-150 bp) 是與 poly (A) 結合蛋白相互作用所必需的。poly (A) 結合蛋白和翻譯起始因子形成復合物招募核糖體啟動翻譯，并且保護帽子結構免受降解酶。
(3) 編碼區側翼的 5’ UTR 和 3’ UTR 調控 mRNA 翻譯、半衰期和亞細胞定位。開放閱讀框包含翻譯成蛋白質的編碼序列，可以通過將很少使用的密碼子替換為編碼相同氨基酸殘基的更頻繁出現的密碼子來優化，從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯量。例如， CureVac AG 公司在新冠疫苗 CVnCoV 用 G 或 C 代替 A 或 U（人類 mRNA 密碼子很少在第三位有 A 或 U）。
圖 1. 將無細胞生產的體外轉錄 mRNA 制成脂質納米顆粒疫苗[1]。
A．體外轉錄 mRNA 的結構示意圖。B. 制備 mRNA 疫苗的過程。(1) 病原體基因組測序完成后，設計目標抗原的序列并插入到質粒中。(2) 在體外通過噬菌體聚合酶將質粒轉錄為 mRNA。(3) 通過液相色譜 (HPLC) 純化 mRNA以去除污染物和反應物。(4) 將純化好的 mRNA 與脂質在微流控混合器中速混合，形成脂質納米顆粒。(5) 將納米顆粒溶液透析或過濾以除去非水溶劑和任何未封裝的 mRNA。(6) 將過濾后的 mRNA 疫苗溶液保存在滅菌的瓶中。
mRNA 疫苗不需要復雜的細胞培養體系和表達純化體系，可在實驗室直接合成，因而可以實現快速大規模生產。這些優勢使得 mRNA 疫苗在 COVID-19 疫情防控中發揮著重要作用。
但 mRNA 不穩定且難以遞送，而且，體外產生的 mRNA 會引起炎癥反應。然而，在兩個關鍵技術上的突破使得 mRNA 疫苗技術高歌猛進。
▐ 脂質納米遞送系統裸的 mRNA 在體液中容易被核酸酶迅速降解，難以在靶組織中積累。此外，免疫系統也能夠識別并降解外源性的核酸引發免疫反應[2]。所以 mRNA 的安全遞送對于 mRNA 疫苗的推廣使用十分重要。脂質納米顆粒可保護核酸不被降解，向靶細胞遞送，并減少核酸對脫靶細胞的暴露。(詳見往期推文：“藥物如何遞送 ？脂質納米顆粒！”)。
基于脂質的納米顆粒是臨床上的 mRNA 遞送載體。截至 2021 年 6 月，所有正在開發或批準用于臨床的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗均采用脂質納米顆粒(LNP)。
圖 2. 脂質納米顆粒及組成[1]。
除了 RNA 藥物之外，LNP 通常還包括四種成分：可電離脂質 (如 DLin-MC3-DMA)、膽固醇 (如 DSPC)、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質 (如 ALC-0159)，它們一起封裝并保護脆弱的 mRNA 核心。▐ 核苷修飾
Katalin Karikó 和 Drew Weissman 發現樹突狀細胞和 TLR 表達的細胞可被細菌和線粒體 RNA 有效激活，但不能被哺乳動物總 RNA（其中含有豐富的修飾核苷）激活[3]。因此，他們假設核苷修飾抑制了 RNA 的免疫作用。通過使用含有修飾核苷的 RNA 刺激樹突狀細胞，發現修飾的核苷確實可以阻止 TLR 受體的識別，特別是修飾的尿苷，誘導的 TNF-α 的表達量顯著降低[3]。
Moderna 和輝瑞-公司的新冠疫苗基于這一結論開發出含有修飾核苷的 mRNA 疫苗。并且這兩款新冠疫苗都在 III 期臨床試驗中產生了 >94% 的療效。
圖 3. Katalin Karikó 和 Drew Weissman 對 RNA 核苷修飾的研究[3][4]。
左圖: RNA 轉染樹突狀細胞誘導表達TNF-α[3]: a. 化學合成 (ORN1-4) 或體外轉錄 (ORN5-6) 的寡核苷酸序列轉染人樹突狀細胞; b-c. ELISA 或 Northern blot 檢測 TNF-α 表達量。右圖: Ψ 修飾的 mRNA 具有更高的翻譯能力[4]: a. 體外轉錄的含有或不含Ψ修飾的 capTEVlucA50 用 poly (A) 聚合酶延長了 3 '端 poly (A) 尾 (+An), 用于動物研究的 mRNA 用星號表示; b-d. 尾靜脈注射含有或不含 Ψ 修飾的 mRNA (capTEVluc-An) 脂質體。處死動物后, (b-c) 對各組織進行熒光素酶活性測定; (d) 并用 Northern blot 檢測 luciferase 和 TNF-α; e-f. 尾靜脈注射含有或不含 Ψ 修飾的 mRNA (capTEVluc-An) 或 pCMVluc 質粒脂質體。處死動物后，(e) 進行熒光素酶活性測定，(F) 用 ELISA 檢測血清中 TNF-α 的含量。
在后續研究中，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 還證明了相比未修飾的 mRNA，修飾后的 mRNA 在實驗小鼠體內具有更高的翻譯能力，可以顯著增加蛋白合成[4]。
至此 mRNA 臨床應用中的關鍵障礙被突破。諾貝爾委員會也正是基于 Katalin Karikó 和 Drew Weissman 這些開創性的發現將今年的諾貝爾生理學或醫學獎授予他們。
(1) 注射的 mRNA 疫苗被抗原提呈細胞內吞。
(2) mRNA 脫離內涵體進入細胞質后，被核糖體翻譯成蛋白質。翻譯后的抗原蛋白可以通過多種方式刺激免疫系統。
(3) 胞內抗原被蛋白酶體分解成更小的片段，這些片段在細胞表面被 Ⅰ 類主要組織相容性復合體 (MHC I) 展示給細胞毒性 T 細胞。
(4) 活化的細胞毒性 T 細胞通過分泌穿孔蛋白和顆粒酶等溶細胞分子殺死受感染的細胞。
(5) 此外，分泌的抗原可以在核內體內降解，并通過 MHC II 類蛋白在細胞表面呈現給輔助T細胞。
(6) 輔助性 T 細胞通過刺激 B 細胞產生中和抗體，并通過炎癥細胞因子激活吞噬細胞，如巨噬細胞，促進循環病原體的清除。
圖 4. mRNA 疫苗引起免疫反應的機制示意]圖[1]。
▐ mRNA 疫苗用于癌癥治療mRNA 疫苗在傳染性疾病防治領域的成功激發了人們對 mRNA 疫苗在癌癥免疫治療領域的應用的興趣 (表 1)[5]。一是通過表達缺失或改變的腫瘤抑制蛋白來修改免疫抑制腫瘤微環境。二是 mRNA 疫苗訓練免疫系統尋找并殺死癌細胞。
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使用帽類似物是體外合成 5’加帽 mRNA 最常用的方法。帽子結構的存在賦予了 mRNA 的穩定性，使其能夠翻譯。 |
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一種二核苷酸帽類似物，可用于體外 RNA 轉錄。 |
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一種含有鎖核酸的三核苷酸帽類似物，可用于體外 RNA 轉錄。 |
[1] Chaudhary N, et al. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation [published correction appears in Nat Rev Drug Discov. 2021 Sep 21;:]. Nat Rev Drug Discov. 2021;20(11):817-838.
[2] Hou X, et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
[3] Karikó K, et al. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
[4] Karikó K, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 2008;16(11):1833-1840.
[5] Barbier AJ, et al. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat Biotechnol. 2022;40(6):840-854.
