oxBS揭示復(fù)發(fā)性膀胱癌的DNA甲基化鑒定預(yù)測PD-L1表達標記物
近日，徐州市中心醫(yī)院（徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院）史振鐸等為第一作者、韓從輝教授為通訊作者在《Biomarker Research》雜志發(fā)表題為“Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression”的研究論文，該研究通過全外顯子組測序、簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）等多組學(xué)方法揭示了復(fù)發(fā)性膀胱癌的甲基化和羥甲基化水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化，并鑒定出用于預(yù)測PD-L1表達的生物標志物。
標題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression
時間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術(shù)平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
研究摘要：
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復(fù)發(fā)率和對免疫治療的響應(yīng)機制仍不清楚，導(dǎo)致臨床結(jié)果預(yù)測困難。表觀遺傳學(xué)變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標志物進行研究。然而，由于此前傳統(tǒng)的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區(qū)分5mC和5hmC信號，導(dǎo)致關(guān)于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學(xué)方法來繪制了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結(jié)果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復(fù)發(fā)或PD-L1下調(diào)幾乎不相關(guān)。整合RRBS和oxRRBS-seq數(shù)據(jù)，鑒定出在復(fù)發(fā)性膀胱癌中顯著富集5hmC相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的脂肪酸氧化相關(guān)基因。在PD-L1高表達的膀胱癌樣本中發(fā)現(xiàn)NFATC1（一種高度參與T細胞免疫應(yīng)答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負相關(guān)，因此僅基于RRBS數(shù)據(jù)結(jié)合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關(guān)信號標記，不適合用作臨床生物標志物。
結(jié)論：通過UBC樣本的多組學(xué)分析，結(jié)果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復(fù)發(fā)和PD-L1調(diào)節(jié)，證明了使用DNA甲基化標記物預(yù)測膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯(lián)合檢測5mC和5hmC水平會降低表觀遺傳生物標志物的預(yù)測準確性，揭示了使用oxRRBS-seq進行甲基化標記發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢。
項目設(shè)計：
（1）樣本選取：
選取行腹腔鏡膀胱根治術(shù)（LRC）、膀胱部分切除術(shù)（PC）或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術(shù)后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進行檢測。共采集45例患者膀胱組織標本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項目設(shè)計流程圖：
結(jié)果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進行5mC和5hmC分析。
（A） 在膀胱癌樣品中鑒定出的顯著5mC和5hmC DMR數(shù)量。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
（B） RNA-seq用5hmC DMR標準化脂肪酸代謝相關(guān)基因數(shù)量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗證。
（D和E）復(fù)發(fā)性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發(fā)生復(fù)發(fā)性UBC的5名患者之間的相關(guān)性。
（B） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關(guān)性散點圖。
（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預(yù)測PD-L1高表達的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預(yù)測PD-L1高表達膀胱癌的一種NFATC1-DMR預(yù)測AUC評分（右）。
總結(jié)：
本研究采用改進的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統(tǒng)RRBS相結(jié)合。oxRRBS可以實現(xiàn)5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細的表觀遺傳學(xué)信息，更適合用作膀胱癌診斷和預(yù)后的生物標志物。
參考文獻：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
標題：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression時間：2023-01-13
期刊：Biomarker Research
影響因子：IF 8.633
技術(shù)平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外顯子組測序等
研究摘要：
背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其高復(fù)發(fā)率和對免疫治療的響應(yīng)機制仍不清楚，導(dǎo)致臨床結(jié)果預(yù)測困難。表觀遺傳學(xué)變化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌進展中起著重要作用，且越來越多地作為診斷或預(yù)后預(yù)測的生物標志物進行研究。然而，由于此前傳統(tǒng)的亞硫酸鹽測序方法（RRBS）不能區(qū)分5mC和5hmC信號，導(dǎo)致關(guān)于羥甲基化知之甚少。
方法：本研究使用多組學(xué)方法來繪制了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膀胱癌的基因組、轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組圖譜。
結(jié)果：本研究通過全外顯子組測序鑒定出參與UBC進展的的基因突變（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而這些基因突變中與UBC復(fù)發(fā)或PD-L1下調(diào)幾乎不相關(guān)。整合RRBS和oxRRBS-seq數(shù)據(jù)，鑒定出在復(fù)發(fā)性膀胱癌中顯著富集5hmC相關(guān)轉(zhuǎn)錄變化的脂肪酸氧化相關(guān)基因。在PD-L1高表達的膀胱癌樣本中發(fā)現(xiàn)NFATC1（一種高度參與T細胞免疫應(yīng)答的基因）基因體中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因組中的5mC和5hmC變化呈負相關(guān)，因此僅基于RRBS數(shù)據(jù)結(jié)合了5mC和5hmC信號，減弱了癌癥相關(guān)信號標記，不適合用作臨床生物標志物。
結(jié)論：通過UBC樣本的多組學(xué)分析，結(jié)果表明表觀遺傳變化比基因突變更多參與UBC復(fù)發(fā)和PD-L1調(diào)節(jié)，證明了使用DNA甲基化標記物預(yù)測膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的潛力。研究還表明僅僅采用RRBS方法聯(lián)合檢測5mC和5hmC水平會降低表觀遺傳生物標志物的預(yù)測準確性，揭示了使用oxRRBS-seq進行甲基化標記發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢。
項目設(shè)計：
（1）樣本選取：
選取行腹腔鏡膀胱根治術(shù)（LRC）、膀胱部分切除術(shù)（PC）或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）的膀胱癌患者組織樣本，采集膀胱腫瘤組織和癌旁組織。手術(shù)后立即用無菌生理鹽水清潔組織，并儲存在-80°C以進行檢測。共采集45例患者膀胱組織標本45份，其中膀胱癌組織45份，癌旁組織18份。
（2）項目設(shè)計流程圖：
結(jié)果圖形
圖1：單堿基分辨率對膀胱癌樣品進行5mC和5hmC分析。
（B） 5mC和5hmC DMR的基因組注釋。
膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。
膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。
圖2：復(fù)發(fā)性膀胱癌的5mC和5hmC分析。
（A） 在復(fù)發(fā)性膀胱癌樣品中鑒定出的5mC和5hmC DMR的數(shù)量（左），5mC和5hmC DMR的基因組注釋（右）。（B） RNA-seq用5hmC DMR標準化脂肪酸代謝相關(guān)基因數(shù)量。
（C） 對TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特異性qPCR驗證。
（D和E）復(fù)發(fā)性膀胱癌中的差異甲基化譜與組織收集后發(fā)生復(fù)發(fā)性UBC的5名患者之間的相關(guān)性。
圖3：PD-L1高表達膀胱癌癥的甲基化變化。
（A） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中鑒定的5mC和5hmC DMR數(shù)量（左），5mC和5hmC DMRs的基因組注釋（右）。（B） PD-L1高表達膀胱癌癥樣本中5mC DMR生物標記物的甲基化變化熱圖。
（C） PD-L1高表達膀胱癌中差異性5hmC水平和差異性5mC水平之間的相關(guān)性散點圖。
圖4：利用5mC生物標志物預(yù)測免疫治療反應(yīng)
（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平變化。（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化預(yù)測PD-L1高表達的膀胱癌AUC評分。
（C） 注釋到NFATC1的5mC DMR軌跡圖（左），預(yù)測PD-L1高表達膀胱癌的一種NFATC1-DMR預(yù)測AUC評分（右）。
總結(jié)：
本研究采用改進的全基因組DNA甲基化和DNA羥甲基化圖譜繪制方法，將氧化還原代表性亞硫酸鹽測序（oxRRBS）與傳統(tǒng)RRBS相結(jié)合。oxRRBS可以實現(xiàn)5hmC至fC的選擇性氧化。羥甲基化水平可以通過從RRBS中減去從oxRRBS獲得的亞硫酸鹽測序信號來確定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分別計算精確的5mC和5hmC水平，從而以更高的分辨率提供更詳細的表觀遺傳學(xué)信息，更適合用作膀胱癌診斷和預(yù)后的生物標志物。
參考文獻：
Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.
標簽：
羥甲基化
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