熒光標記指將熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，具有無放射物污染、操作簡便、容易觀察等優點，可借助熒光特性對被標記對象進行定性、定位以及定量分析。熒光標記在蛋白質、核酸、細胞檢測及免疫分析等方面顯現出巨大潛能。

表 1. 常見的用于蛋白偶聯反應基團。

反應很多，本篇只講 NH₂ 和 SH 反應 ，在文章末尾小 M 會告訴大家基本的原理！在這里我們先來到大家最關注的環節：如何標記蛋白？以及使用過程中有哪些注意事項？

染料標記蛋白，主要包含以下步驟：

 

蛋白標記時蛋白溶液的配制，以下幾點十分重要！  

• 關于溶解：溶解蛋白時，要根據推薦的溶劑進行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或銨離子的緩沖液，它們與待標記蛋白會發生競爭反應降低標記效率。低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會顯著干擾蛋白標記，但是 20-50％ 的甘油會降低標記效率。

• 標記蛋白濃度：蛋白濃度過低會大大影響標記效率，一般濃度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白濃度過低，可用超濾管濃縮蛋白。

注意事項：蛋白必須在不含伯胺和銨離子的緩沖液中，這些基團會和蛋白爭奪結合位點，會影響標記效率。

蛋白溶液配好了，我們現在開始配染料溶液，使用無水 DMSO 配制染料溶液 (多為 10 mM )，染料在 DMSO 穩定性較好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分裝保存 1 個月。如果是水溶解，染料有易被水解的性質，建議現配現用。

我們在標記時，首要注意的是染料和蛋白的配比問題，染料過少，反應不完全，標記量太少，染料過多，則不易純化。通常，我們推薦染料與蛋白的摩爾比在 5:1-20:1。
 
 

 案例：

此處我們以 CY3 為例，假如所需標記蛋白為 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 µL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，則所需 CY3 體積為 3.95 μL，詳細計算流程如下：

1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol

2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol

3)µL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/µL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/µL =3.95 µL 

 

 

了解配比后，我們開始孵育，一般將染料和蛋白一起室溫孵育 2 h 即可完成結合！

熒光標記結束后，我們需要純化蛋白去掉多余未結合染料防止其對實驗的干擾，常用的純化工具為親和層析柱和透析袋。

表 2. 層析柱和透析袋的對比。

 

忙忙碌碌終于大功告成，那么如何檢測我們是否標記成功呢，通常是以下幾種：

• 直接肉眼觀察，根據上面的純化原理可以得知，如果得到的產物有顏色。我們默認標記成功；

• 熒光顯微鏡觀察，通過熒光顯微鏡在對應通道進行拍攝，如果觀察到特定形態熒光信號即為標記蛋白；

• 蛋白電泳實驗，標記后蛋白本身分子量會增大，蛋白存在微小向上拖帶可以證明標記成功（如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發生降解）。

• 使用分光光度計測定 F（熒光素）和 P（抗體蛋白）的比值（F/P），F/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質量，一般要求 F/P 的克分子比值為1～3。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，標記效率低。

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下面是原理解答時間！

• 關于蛋白氨基反應

伯胺 (-NH₂) 存在于每條多肽鏈的 N-末端 (稱為 α-氨基) 以及賴氨酸殘基的側鏈中(稱為 ε-氨基)。由于伯胺在生理條件下帶正電荷，因此它通常朝外，使得其更易于偶聯而不會使蛋白質結構改變。從我們的表中可以看出，許多反應基團均可以和伯胺基結合，而在熒光標記中，最常用的是還是 NHS 活化酯 (SE)[1]。

圖 1. NHS 酯圖示。

NHS 活化酯 (SE)
NHS，全稱為 N -羥基琥珀酰亞胺酯，是 EDC (碳二亞胺) 活化羧酸分子形成的反應基團。帶有活化的 NHS 酯的交聯劑 和標記化合物在弱堿性條件下與伯胺反應， 產生穩定的酰胺鍵 (圖 3)。該反應釋放 N-羥 基琥珀酰亞胺 (NHS)，可通過透析或脫鹽輕易去除[2]。

• 關于蛋白巰基反應

巰基 (-SH) 存在于半胱氨酸的側鏈中。在進行交聯反應時，必須將其還原成巰基，使其可以與大多數類型的反應基團進行交聯。巰基對馬來酰亞胺、鹵代乙酰基和吡啶二巰基具有反應活性，在蛋白巰基標記中，馬來酰亞胺的熒光探針最為常見[3]。

圖 3. 馬來酰亞胺圖示。

馬來酰亞胺（Maleimides） 
馬來酰亞胺是一種非常常用的反應活化基團，當反應混合物的 pH 值在 6.5-7.5 之間時，馬來酰亞氨基團會與巰基基團特異性反應，形成不可逆的穩定硫醚鍵。在堿性更強的條件下（pH>8.5），支持伯胺偶聯，并且還會增加馬來酰亞氨基團水解成非反應性馬來酰胺酸的速率。馬來酰亞胺不與酪氨酸、組氨酸或蛋氨酸反應。需要注意的是，馬來酰亞胺酯是一種非活化染料，使用帶有馬來酰亞胺酯的熒光探針時，需用 DTT 活化后方可進行后續標記[4]。

[1] Mattson G, et al. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep. 1993 Apr;17(3):167-83. 
 
[2] Grabarek Z, et al. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal Biochem. 1990 Feb 15;185(1):131-5. 

 

[3] Staros JV, et al. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal Biochem. 1986 Jul;156(1):220-2. 

 

[4] Timkovich R. Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal Biochem. 1977 May 1;79(1-2):135-43.