在漫長而充滿挑戰的藥物研發過程中，需要通過確定候選藥物對細胞靶點的親和力以及相互作用的動力學來篩選候選藥物。表面等離子體共振（SPR）、生物膜干涉測量法（BLI）、石英晶體微天平（QCM）和表面聲波（SAW）等多種有標記和無標記的方法被用于對從細胞中提取的或重組表達分離的蛋白進行動力學研究。這些技術要求將提純的蛋白質固定在傳感器表面，以便測量其與溶液中分析物的相互作用。

不幸的是，異源蛋白的表達和純化很繁瑣，并引入不確定性，如天然構象的改變，這可能會改變表達蛋白的結構和行為。此外，由于各種細胞異質性因素，如細胞表型、生長周期、膜的剛性、受體的可及性和構象以及鄰近蛋白的影響，分離提純蛋白受體的結合動力學可能與細胞原位天然受體的結合動力學大不相同。天然蛋白受體與分離提純蛋白受體之間的這些生理差異及其對受體功能的潛在影響，使得基于細胞原位的相互作用分析方法更具藥理學相關性和生物學意義。
 

圖1，不同形式的抗HER2抗體與HER2分子結合示意圖

 有幾種方法可用于測量細胞天然受體的結合動力學，如表面等離子體共振顯微鏡（SPRM）、配體示蹤劑（LT）和石英晶體微天平（QCM）。然而，SPRM 是唯一具有單細胞分辨率的技術，因此能夠直接解決細胞異質性問題。這種固有的異質性會產生范圍廣泛的結合相互作用行為，而不能像通常的做法那樣，簡單地將整個細胞群的行為平均處理。

本案例對人表皮生長因子受體 2（HER2）的天然形式和重組形式的結合動力學進行了詳細研究和比較。由于各種因素的影響，重組形式和天然形式的 HER2 受體的取向可能不同。圖 1 展示了通過（A）胺基偶聯固定在葡聚糖基質芯片和（B）靜電作用固定在培養皿上的 HER2 重組蛋白。固定化后，重組 HER2（rHER2）受體的結構域 IV 可及性更好。然而，細胞原位天然受體HER2是定向的，結合結構域 IV 非常靠近(C)活細胞和(D)固定細胞的細胞膜。因此，細胞膜可以通過對抗體施加一定的立體位阻影響相互作用。通過對不同受體方向的觀察，我們可以發現，提純的重組 HER2 受體固定后，結合域 IV 比其天然形式更容易接近。

利用 SPRm200 系統研究了抗 HER2 抗體與 SKBR3 細胞原位的 HER2 的結合動力學，并與分離提純的 rHER2 的結合動力學進行了比較。培養 SKBR3 細胞并讓其附著于二分之一的聚賴氨酸涂層傳感器表面（圖 2A）；另一半傳感器表面用作參照區。進行系列動力學滴定注射，使細胞先后暴露于6種濃度的anti-HER2-FITC 溶液（1.00、5.00、10.00、20.00 和 50.00 nM）中。

                                  圖2，SPRm200細胞原位分子互作動態分析系統實驗分析

ImageSPR™ 軟件用于分析 SPRM 傳感圖。圖 2B 顯示了單個感興趣區 (ROI) 的代表性結合反應。對藍色 ROI 中觀察到的結合反應進行分析，以生成圖 2C-E 中的結合直方圖。對直方圖進行高斯分布擬合，以確定每個動力學參數的平均值和 95% 的置信區間。抗體與天然 HER2 受體之間的結合相互作用遵循 1:2 結合模型。這一觀察與先前的研究結果非常吻合，先前的研究表明赫賽汀與天然和糖基化的 HER2 受體的結構域 IV 的結合方式為 1:2 結合，與非糖基化受體的結合力更強，而與糖基化受體的結合力更弱。

將從 SKBR3 細胞的天然受體獲得的動力學相互作用值與從提純、固定的重組受體獲得的值進行了比較。對重組受體rHER2 蛋白的結合研究是在采用 BI-DirectFlow™ 技術的五通道 BI-4500A SPR 系統上進行的。rHER2 分子通過胺基偶聯固定在羧甲基葡聚糖（CM-葡聚糖）傳感器芯片上。

                   圖3，BI-4500A多功能分子互作分析儀實驗分析

由于 rHER2 受體上缺乏糖基化修飾，因此采用更簡單的 1:1 相互作用動力學模型進行擬合分析（圖 3）。如表 1 所示，與重組受體相比，細胞內天然受體的結合速率較慢。這一點在第二組細胞原位動力學峰上表現得尤為明顯，這些峰歸因于糖基化，其結合率慢約 3.5 倍，親和力弱約 17 倍。我們懷疑提純的 rHER2受體固定后的取向和缺乏糖基化阻礙有助于提高 rHER2 受體結合域 IV 的可及性，從而使抗體結合速率更快，親和力更強。

                   表1，抗 HER2 抗體與細胞原位HER2和重組 HER2 相互作用測得的動力學參數

本案例在細胞原位天然蛋白受體形式和固定重組蛋白受體形式之間觀察到了截然不同的相互作用行為。這些差異凸顯了基于細胞原位的分子互作動力學研究對藥物開發的重要性，從而能更全面地評估藥效、生物相關藥效代動力學和基本的細胞生物學過程。

SPRm200系統將光學顯微鏡與分子互作技術相結合，專為觀察和測量細胞膜表面蛋白和其他目標分子結合親和力及動力學常數設計，為分子相互作用的研究開辟了新的前沿。

(1)SPRm200系統無需對觀察目標進行標記，可以實時定量的進行檢測；

(2)可同時可視化觀察細胞結構和局部結合活性；

(3)無需提取細胞膜蛋白，即可在正常活細胞狀態下觀察和測量藥物和膜蛋白的實時相互作用；

(4)探測器測量每個像素的SPR響應，并將其映射到SPR圖像中，在每個像素處，記錄一個傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術使在自然條件下研究細胞表面膜蛋白與其他目標分子結合和相互作用成為可能。SPRm200細胞原位分子互作動態分析系統憑借其卓越的靈敏度和穩定性，助力科學研究新發現，推動藥物開發新高度。

參考文獻

1) Wang, Qi, et al. "Research advances on surface plasmon resonance biosensors." Nanoscale 14.3 (2022):564-591.

2) Olaru, Andreea, et al. "Surface plasmon resonance (SPR) biosensors in pharmaceutical analysis." Critical reviews in analytical chemistry 45.2 (2015): 97-105.

3) Tao, Yi, et al. "Tailored biosensors for drug screening, efficacy assessment, and toxicity evaluation." ACSsensors 6.9 (2021): 3146-3162.

4) Dong, Tianbao, et al. "Live Cells versus Fixated Cells: Kinetic Measurements of Biomolecular Interactions with the LigandTracer Method and Surface Plasmon Resonance Microscopy." Molecular Pharmaceutics (2023).