cfDNA甲基化診斷和監測腫瘤的研究進展與展望之胰腺癌
胰腺癌因其病死率高而成為目前最具挑戰性的惡性腫瘤之一。考慮到目前的治療方案診斷較晚，生存獲益有限，優化早期檢測、預后和治療反應預測勢在必行。近年來大量研究以開發基于液體活檢的胰腺癌生物標志物。越來越多研究指出，細胞游離DNA (cfDNA)甲基化分析是一種有前景的非侵入性方法，可用于發現和驗證具有診斷或預后潛力的表觀遺傳生物標志物。本文就胰腺癌中cfDNA甲基化的研究進展進行綜述，討論了DNA甲基化在胰腺癌中的相關性、近期cfDNA甲基化研究及其臨床應用，以及將cfDNA甲基化分析應用于常規臨床實踐的未來方向。
背景介紹（Introduction）
胰腺癌是發達國家死亡率第三高的腫瘤，也是3年生存率最低的腫瘤（5%）。胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常見的胰腺癌類型，占所有病例的80%以上。目前碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是胰腺癌臨床診斷中唯一常規使用的血液生物標志物，其靈敏度（79%）和特異性（82%）相對較低。轉移性PDAC患者的CA19-9水平與生存率之間存在關系。 在臨床實踐中，對于疾病過程中CA19-9水平變化的解釋尚未達成共識。
因此，開發基于血液的胰腺癌替代生物標志物勢在必行，這些生物標志物有助于早期診斷、精準分層、選擇適當的治療方案、監測治療反應、評估治療耐藥性、鑒定微小殘留病灶和復發風險。液體活檢是對循環血液成分中的分子生物標志物進行分析，已成為克服癌癥診斷和監測挑戰的一種有前景方法(圖1)。通過檢測和分析血液中循環游離DNA（cfDNA）、循環腫瘤細胞（CTC）和其他生物標志物的基因突變，液體活檢為評估腫瘤特征和監測治療應答提供了一種非侵入性方法。
圖1：血液液體活檢在胰腺癌診斷和治療中的應用。循環腫瘤細胞(CTCs)和循環游離DNA (cfDNA)是液體活檢的重要生物標志物，可提供非侵入性診斷、預后和治療信息。特別是cfDNA分析可以揭示引發腫瘤的遺傳學變化，如基因突變、微衛星不穩定性(MSI)、雜合性缺失(LOH)或異常甲基化模式。在胰腺癌患者的cfDNA中最常檢測到的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4和FBXW7。在胰腺癌中，與甲基化相關的循環生物標志物有BNC1、NPTX2、SFRP1、RASSF1A和TFPI2。
在癌細胞中經常觀察到異常的DNA甲基化模式變化，這些變化可反映在血液循環中的cfDNA中。檢測血流中的這些甲基化變化有望用于早期癌癥檢測，并有可能通過及時干預改善結局。本文首先對cfDNA在胰腺癌中的研究進行回顧；然后分析了DNA甲基化在胰腺癌背景下的相關性，總結cfDNA甲基化的最新研究，特別強調其臨床效用；最后討論了cfDNA甲基化分析的未來方向、臨床轉化以及將其應用到常規臨床實踐中的可能性。
循環cfDNA作為胰腺癌的血液生物標志物
那些存在于血液中的DNA片段被稱為循環游離DNA (cfDNA)，cfDNA可來源于正常細胞更新、凋亡或壞死細胞以及腫瘤細胞等。在cfDNA中可以檢測到腫瘤特異性遺傳學變化，包括基因突變、微衛星不穩定性(MSI)、雜合性丟失(LOH)和異常甲基化模式。cfDNA大小為40~200個堿基對(bp)，peak值約為166bp，健康個體中cfDNA片段長度中位數比癌癥患者大。
與腫瘤組織活檢相比，cfDNA不僅更好地描述了腫瘤的完整情況，而且提供了重復采樣和分析的可能性，從而可以縱向評估cfDNA濃度的動態變化、鑒定獲得性耐藥突變和監測克隆進化。然而將cfDNA作為癌癥的血液生物標志物進行分析也有一些局限性。cfDNA診斷和預后效用的一個重要方面是其血漿低濃度，這使檢測和分析更為復雜化。據估計，每毫升血漿中約有10-15 ng cfDNA，在大多數早期癌癥中，循環腫瘤DNA只占cfDNA的一小部分。這些考慮突出了對超靈敏檢測方法的要求。最靈敏的方法是基于聚合酶鏈反應(PCR)方法，如BEAMing單分子PCR、TAm-Seq、數字PCR和微滴數字PCR。胰腺癌的cfDNA作為一種有前景的早期檢測和預后生物標志物受到越來越多關注。最近的研究表明，80%以上的轉移性胰腺癌患者中檢測到循環cfDNA的遺傳學變化，但僅在48%的局限性腫瘤患者中檢測到。
胰腺癌在雜合性缺失(LOH)情況下，對微衛星不穩定性(MSI)進行的液體活檢研究非常罕見或不存在。Chakrabarti等評估了使用Guardant360技術分析了循環腫瘤DNA中的MSI狀態可否預測PDAC患者對免疫治療的穩健應答。結果表明在83%的患者的組織MSI結果與血漿G360結果一致。此外，在1例患者的腫瘤組織中未檢測到MSI，而血漿中檢測到MSI。
胰腺癌中最常見的血液生物標志物研究包括對cfDNA循環突變分析，最常見的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4或FBXW7。這些突變與腫瘤中發現的突變同時發生，強調了cfDNA作為有價值的胰腺癌血液生物標志物的潛力。一些研究已經證實了在循環cfDNA中檢測到KRAS突變與局部晚期或轉移性PDAC患者的不良預后相關。此外，一些研究還將檢測循環cfDNA中的KRAS突變作為生物標志物，用于監測治療反應和鑒定胰腺癌耐藥的早期跡象。在最近的一項研究中，不可切除胰腺癌患者的cfDNA中存在KRAS突變與不良治療結果強相關，并提示這一分子評估可作為評估早期腫瘤進展的生物標志物。
目前的研究強調了cfDNA作為預測PDAC患者預后有價值的生物標志物來源潛力。在整個治療過程中，cfDNA基因圖譜變化可作為治療應答或耐藥的早期指標，從而為利用生物標志物進展來指導治療決策提供了一個有前景的途徑。
盡管如此，仍然迫切需要推進更靈敏技術的開發，這些技術能夠增強對腫瘤來源的循環DNA檢測，并提高預后預測的準確性。超靈敏技術結合和表觀遺傳標記(如cfDNA甲基化)的整合為提高胰腺癌cfDNA分析的靈敏度和特異性提供了一個有希望的機會(圖1)。
DNA甲基化與胰腺癌
近年來，試圖鑒定胰腺癌中甲基化標志物的研究越來越多。DNA甲基化可逆，從治療角度來看具有很高的研究價值。DNA甲基化在CpG二核苷酸胞嘧啶C5位點上添加或移除一個甲基(CH3)，CpG二核苷酸主要存在于CpG島的特定基因組區域中。在哺乳動物中，DNA甲基化模式構建主要由DNA甲基轉移酶3 (DNMT3)家族介導，包括DNMT3A和DNMT3B。一旦構建，這些模式隨后通過DNMT1作用來維持。在正常細胞中，正確DNA甲基化模式保證了基因表達的正確和精確調控，并維持穩定的基因沉默。因異常甲基化模式被廣泛認為是許多類型癌癥的表觀遺傳標志，通常在癌癥中觀察到低甲基化和高甲基化事件。具體來說，在基因缺失區域和重復序列中，甲基化CpG含量整體下降；從而導致基因組不穩定，激活先前沉默的致癌基因。癌癥常表現為基因啟動子的局部高甲基化，導致抑癌基因的轉錄沉默。
目前對胰腺組織活檢、細胞系或異種移植模型的大量研究來解讀胰腺疾病的特異性甲基化模式，以作為胰腺腫瘤的診斷或預后工具。在胰腺癌中，近80%的病例顯示DNMT1表達上調，導致高甲基化。高甲基化被認為是胰腺癌中最主要的異常表觀遺傳學改變。這種異常高甲基化的影響主要在腫瘤抑制基因中觀察到。CDKN2A/p16INK4是胰腺癌中第一個因啟動子異常高甲基化而失活的抑癌基因，它在抑制細胞周期由G1期向S期進展，確保細胞周期停滯中起著至關重要的作用。在胰腺外分泌和上皮內腫瘤新鮮冷凍組織、人胰腺癌細胞系和異種移植物中進行的其他研究表明，在胰腺癌中，細胞通過G1期進展的其他負調控因子，如細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑CDKN1C/p51KIP2和細胞周期蛋白CCND2的高甲基化和隨后的下調。在胰腺腫瘤中，由于異常高甲基化而導致表達降低的其他腫瘤抑制基因包括前腦腦肽原(PENK，在分析的93.3%的腫瘤樣本中高甲基化)、細胞因子信號轉導抑制基因1 (SOCS-1, 57.1%)、原鈣黏蛋白10 (PCDH10, 60.9%)、iroquois同源盒4 (IRX4, 64%)和reprimo (RPRM, 57%)等。
胰腺癌中除抑癌基因異常高甲基化外，某些基因也存在異常低甲基化。這種低甲基化主要發生在特定基因的啟動子區，導致其過表達，從而促進胰腺癌細胞的增殖、存活和侵襲。其中一個基因是絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINB5 (Maspin)。據報道SERPINB5基因在87%的胰腺癌細胞系(20/23)、94%的異種移植物(32/34)中完全未甲基化，在86%的原發性胰腺癌(6/7)中低甲基化，該基因甲基化與mRNA表達水平呈負相關。在臨床樣本中，未甲基化SERPINB5的存在已經證明了其作為胰腺腫瘤特異性生物標志物的潛力，使胰腺導管腺癌(PDAC)與胰腺炎的鑒別成為可能。通過將甲基化和表達譜數據相結合的多組學分析，有令人振奮的證據表明，在胰腺癌組織中，與低甲基化狀態相關的特定基因上調，包括磺基轉移酶家族1E成員1 (SULT1E1)、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白3 (IGF2BP3)和絲裂原活化蛋白4激酶4 (MAP4K4)。這些基因的甲基化和表達譜變化與胰腺癌患者的總生存期顯著相關，因此提示它們作為預后生物標志物的潛在效用。另外幾個基因在胰腺癌組織中因異常低甲基化而過表達，包括MUC4、CLDN4、LCN2、SFN、TFF2、S100A4、MSLN和PSCA。
此外，近年來，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)作為一種生物學功能尚不明確的氧化形式的5mC，作為癌癥診斷和生存的潛在生物標志物引起了極大的興趣。一些研究報道，5hmC水平在人類癌癥中顯著降低，胰腺癌被描述為導致游離細胞羥甲基化的疾病特異性變化。
綜上所述，表觀遺傳改變在胰腺癌的發生發展中起著關鍵作用。因此，對胰腺癌發生的異常表觀遺傳修飾進行綜合分析，對胰腺癌的分子診斷和治療監測具有重要意義。
胰腺癌cfDNA甲基化研究分析
對胰腺癌血漿中甲基化生物標志物的探索仍處于早期階段，迄今為此開展的研究數量有限。胰腺癌的cfDNA甲基化模式分析已在全基因組水平以及通過鑒定和描述單個基因或小基因panel來進行。關于全基因組測序方法，已經發表了多項研究。本文主要探究單個基因或小基因panel作為未來臨床應用的潛在生物標志物的效用 (表1)。首項關于鑒定血漿中胰腺癌甲基化標志物的研究始于2007年。Jiao等通過甲基化特異性PCR (MSP)檢測了83例未經治療的胰腺癌患者血漿樣本中ppENK和p16基因的甲基化狀態。ppENK和p16啟動子甲基化率分別為29.3%和24.6%。在83例患者中，9例成對的胰腺腫瘤組織切片在相同甲基化的腫瘤患者血漿樣本中，p16和ppENK基因的高甲基化率分別為60%和80%。作者得出結論，血漿DNA在檢測胰腺癌表觀遺傳學變化中可能具有替代腫瘤組織的價值。然而對于潛在診斷標志物而言，所獲得的靈敏度太低，這可能是由于分析的成對血漿/腫瘤樣本數量少。此外，本研究缺乏健康人和良性胰腺疾病患者組成的對照組數據。
表1：血漿/血清中游離DNA甲基化作為胰腺癌診斷和/或預后生物標志物的研究
此后不久，另一項開創性研究發表，表明可以通過使用血漿中循環cfDNA的甲基化譜來檢測胰腺癌。Melnikov等分析了30例PDAC患者和30例年齡匹配的健康志愿者的甲基化特征。當時引入了一種名為MethDet56的新技術，該研究使用了包含56個頻繁甲基化基因的芯片檢測panel。這一創新方法旨在通過甲基化靈敏的核酸內切酶消化標靶序列，然后使用PCR擴增未消化的片段，從而檢測標靶序列的甲基化水平。CCND2、PLAU、SOCS1、THBS和VHL等5個基因在PDAC患者血漿中的甲基化水平低于健康對照組，低甲基化模式的靈敏度為76%，特異性為59%。作者將這組基因歸類為復合生物標志物，從而確立了其對采用基于血漿的方法檢測胰腺癌的一致預測價值。此外，他們認為啟動子的非甲基化狀態在腫瘤檢測方面更有價值。然而這些發現尚未得到后續研究驗證，并且將血漿cfDNA中的低甲基化特定基因用作PDAC的生物標志物仍然是一個有爭議的話題。
同一研究小組使用他們開發的MethDet56方法，比較30例PDAC患者、30例慢性胰腺炎患者和30例健康對照者血漿cfDNA甲基化，每組年齡、性別和種族分布相似。為了確定血漿中的特異性甲基化譜，研究者選擇了8個含信息基因（informative genes ）(BRCA1、CCND2、CDKN1C、MLH1、近端和遠端PGR啟動子區、SYK和VHL)的啟動子，以區分慢性胰腺炎和健康對照(靈敏度為78%，特異性為81.7%)。當比較慢性胰腺炎和PDAC時，他們發現14個基因啟動子(CCND2、CDKN1C、CDKN2B、DAPK1、ESR1啟動子A、MGMT、MLH1、MUC2、MYOD1、PGK1、PGR啟動子近端區域、RARB、RB1和SYK)存在差異甲基化(90.8%靈敏度和91.2%特異性)。14個基因啟動子中有9個為慢性胰腺炎特異性啟動子，5個為兩組共有。在這組共有的5個基因中觀察到在慢性胰腺炎中高甲基化的基因在PDAC中低甲基化。
幾年后，MethDet56方法被用于研究PDAC和結直腸癌(CRC)是否在血漿cfDNA中的共有甲基化標志物。7個基因panel(MDR1、SRBC、VHL、MUC2、RB1、SYK和GPC3)被鑒定為區分CRC或PDAC與健康對照的最佳循環甲基化標簽。此外，一項該panel進行的限制性更強的分析結果表明，GPC3是有效區分PDAC和健康對照的唯一基因，而VHL和SRBC是PDAC和CRC的信息基因。
Park J.W.等在2012年發表了兩項研究，使用MSP技術在血漿中診斷胰腺癌。第一項是初步研究(16例胰腺癌患者，13例慢性胰腺炎患者和29例健康對照)，該研究使用了6個候選基因，這些候選基因基于Sato等人2003年在原發性胰腺癌和正常胰腺導管上皮中獲得的結果選擇。UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A基因啟動子在PDAC患者和健康對照之間存在差異甲基化，但p16基因啟動子在PDAC患者和慢性胰腺炎患者之間存在差異甲基化。慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危險因素，繼這些結果和之前從胰腺癌細胞學樣本中獲得結果之后，作者重點研究了一個更大的血漿隊列中NPTX2的甲基化狀態，該隊列包括104例PDAC患者、60例慢性胰腺炎患者和5例良性膽道結石患者。NPTX2甲基化在PDAC組中顯著升高(84%的PDAC患者，慢性胰腺炎和良性膽石病組分別為33%和0%;P = 0.016)，其靈敏度和特異性分別為80%和76%，且與腫瘤分期的惡化呈正相關。
Singh及其合作者于2020年分析了Park等2012年檢測的6種生物標志物中的3種(UCHL1、PENK和NPTX2基因啟動子)，并將SPARC基因加入研究。從61例PDAC患者、22例慢性胰腺炎患者和21名健康受試者的cfDNA中通過定量MSP (qMSP)獲得的絕對拷貝數計算基因甲基化指數(MI)。這4個基因在PDAC中的MI顯著高于健康對照組，SPARC MI能夠鑒別早期PDAC和慢性胰腺炎。此外，較高的UCHL1 MI與疾病的晚期相關；SPARC和NPTX2基因的高MI與PDAC的低生存率相關。
2013年，Kawasaki等利用MSP技術研究了不同類型癌癥患者（包括47名PDAC患者）cfDNA中細胞周期相關基因(APC、DCC、p16、p14、RASSF1A)的甲基化率。RASSF1A和APC的甲基化率最高，分別為34和23.4%，其次為p16和p14。然而本研究缺乏健康對照組，且RASSF1A甲基化百分比在其他類型的癌癥如肝細胞癌中相似甚至更高。
同樣在2013年，Yi等通過轉錄組微陣列對4種胰腺癌細胞系中獲得的1427個特異性基因進行癌癥特異性甲基化過濾后，通過MSP分析了8個候選基因的甲基化狀態。bbnc1和ADAMTS1啟動子基因在原發性PDAC腫瘤樣本中表現出最高的甲基化率(分別為91%和67%;n=123)和癌前胰腺上皮內瘤變(PanIN)樣本(分別為70%和25%;n=20)。然后使用甲基化磁珠(Methylation On Beads, MOB)方法在血清樣本(42例PDAC患者和26名健康個體)中驗證這些生物標志物，這是一種捕獲、保留和亞硫酸鹽處理微量DNA的納米技術。在I期PDAC樣本中，BNC1的靈敏度達到79%，ADAMTS1的靈敏度達到48%，這兩個基因的靈敏度均提高至90%。BNC1和ADAMTS1的特異度分別為89%和92%。結合這兩種基因，檢測極早期胰腺癌的靈敏度提高(81%)，但特異性未提高(85%)。
9年后，同一組研究人員通過qMSP方法在39例PDAC患者、95例匹配的年齡對照和8例慢性胰腺炎患者組成的獨立隊列中驗證了這組有前景的生物標志物。在87.2%和65.1%的PDAC病例中檢測到ADAMTS1和BNC1甲基化，而在非癌癥患者中分別檢測到4.2%和6.3%。兩基因組合(ADAMTS1和/或BNC1)改善了個體結果，在患者和對照中分別達到97.4%和8.4%的甲基化水平。該組合也在87.5%慢性胰腺炎樣本中顯示了甲基化，未能區分PDAC和慢性胰腺炎。在I期、IIA期、IIB期、III期和IV期胰腺癌患者中，ADAMTS1 / BNC1組合的cfDNA甲基化率分別為100%、88.9%、100%，將CA19-9納入分析后，未見明顯改善。根據這些結果，作者強調ADAMTS1和BNC1是在疾病初期階段cfDNA中早期檢測胰腺癌的可靠標志物，這為治愈性腫瘤切除術提供了治療機會。
2021年，為了提高診斷潛力，同一研究組將LRFN5和PXDN基因加入到ADAMTS1/BNC1聯合甲基化panel中。采用MSP法檢測106例FFPE組織樣本(44例PDAC (I-IV期)、15例PanIN、24例導管內乳頭狀黏液性腫瘤、15例慢性胰腺炎和8例非癌對照) 中的甲基化水平，并使用MOB和qMSP檢測32例血漿(22例PDAC (I-IV期)和10例健康對照)中甲基化水平。
將LRFN5/PXDN添加到生物標志物組中提高了癌前和早期癌癥檢測的診斷準確性，AUC為0.94。此外，在血漿中獲得的4個基因組的靈敏度和特異度分別為100%和90%。本研究納入的人群具有多樣性，增強了研究結果的廣泛適用性。血漿樣本量明顯小于腫瘤組織樣本量。作者認為，cfDNA中4基因組的甲基化頻率與組織中相當，盡管較低，可能是由于存在腫瘤異質性，這表明這些生物標志物基因對能夠血行擴散的腫瘤克隆至關重要。
Henriksen團隊采用了一種獨特的方法，專注于開發基于cfDNA甲基化的預測模型，用于胰腺癌診斷、生存預測和預后。2016年，Henriksen等人利用優化亞硫酸鹽處理方案和兩輪MSP和qMSP(外部和內部甲基化特異性引物和探針)評估了基于之前文獻的發現選擇的28個基因panel。共納入95例PDAC患者，其中慢性胰腺炎組97例，急性胰腺炎組59例，胰腺良性疾病組27例�；诙嘧兞縧ogistic回歸分析，建立了包含8個基因(APC、BMP3、BNC1、MESTv2、RASSF1A、SFRP1、SFRP2和TFPI2)的預測模型(年齡> 65歲)，該模型能夠成功鑒別良惡性病變，靈敏度為76%，特異度為83%。作者強調了這一預測模型與癌癥分期的獨立性，并得出結論，認為該模型有可能用作胰腺癌的早期血液診斷工具。
隨后，采用相同的28個基因組、相同的PDAC患者隊列和相同的實驗方法，只發現IV期高甲基化基因的平均數量有非常顯著的差異，但在I、II或III期則沒有，表明在癌癥發生和進展過程中，高甲基化啟動子區域有積累。他們開發了能夠區分IV期PDAC患者與無遠處轉移的患者(I、II和III期)，以及可能可切除的PDAC患者(I和II期)與不可切除的PDAC患者(III和IV期)的預后預測模型。
同樣在2017年，該研究組利用這一隊列建立了PDAC患者的生存率與血漿來源的cfDNA中高甲基化基因之間的相關性。作者發現，cfDNA中有10個以上高甲基化基因的患者生存率顯著較低，這些基因因胰腺癌分期而異。通過多變量Cox回歸分析建立的最終生存預測模型由5個基因(BNC1、GSTP1、SFRP1、SFRP2和TFPI2)和美國麻醉醫師協會(American Society of Anesthesiologists, ASA)身體狀態評分為3分(表明患者患有嚴重全身性疾病)組成。除SFRP2基因甲基化與較長的生存期相關外，其他基因甲基化均與較差的預后相關。在Henriksen及其同事所描述的三項研究中，高甲基化被作為定性二元變量進行分析，導致了定量信息的丟失。
2021年，這些研究者對他們之前發表的PDAC診斷預測模型(BMP3、RASSF1A、BNC1、MESTv2、TFPI2、APC、SFRP1和SFRP2)進行外部驗證，并研究了CA 19 - 9血清對診斷試驗預測性能的額外影響。對346例PDAC(I-IV期)和25例慢性胰腺炎患者的cfDNA樣本進行的初始28個基因panel的MSP結果顯示，與慢性胰腺炎患者相比，PDAC患者的高甲基化基因數量較高(8.11 vs. 5.60)。診斷預測模型驗證的AUC為0.77，略低于2016年的第一項研究(0.86)。作者解釋說主要研究是基于訓練數據，可能由于過度擬合而高估了測試表現，從而證明了這一差異。將該檢測與血清CA19-9值相結合，AUC為0.85(在主要研究中為0.93)，作者得出結論，這兩種標志物的聯合使用可以作為臨床上有用的PDAC診斷工具。重要的是要考慮到，除了在驗證分析中納入的對照個體數量少之外，病例和對照在年齡或吸煙方面不匹配，而這兩個因素都是影響甲基化狀態的重要因素。
Xiao-Bin Li等人于2019年對BNC1和SEPT9基因進行了重新分析，這些基因先前被描述為胰腺癌癥的潛在循環生物標志物。qMSP檢測結果顯示，在57名PDAC患者、14名PanIN病變患者、44名良性疾病患者和53名健康對照中，兩個基因的循環甲基化水平存在顯著差異，腫瘤患者組的甲基化水平更高。這些標志物與CA19-9聯合用于診斷癌癥的靈敏度和特異性分別為86%和81.1%。然而，這些標志物可能在大約1/3的良性胰腺疾病以及其他癌癥中（如結直腸癌癌癥、癌癥和肝細胞癌）發生甲基化。
2020年，Shinjo及其同事進行了Illumina Infinium全基因組DNA甲基化分析，靈敏度達到98%，并指出在有KRAS突變的胰腺癌組織中，ADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A和SPSB4是甲基化最高的基因。隨后使用了一種新型且靈敏的方法(MBD-ddPCR)富集偶聯甲基化CpG結合蛋白，并在血清樣本(47例PDAC患者和14例正常對照)中驗證了這5個標記基因的甲基化狀態。雖然在癌癥患者和對照之間未觀察到顯著差異，但49%的PDAC患者至少有一個基因甲基化，因此靈敏度為49%，特異度為86%。cfDNA甲基化狀態和KRAS突變聯合應用提高了診斷性能，靈敏度為68%，特異度為86%。一個懸而未決的問題是，如果將一組良性胰腺疾病患者納入研究，將如何比較cfDNA甲基化模式。
2020年，Li和同事使用MeDIP-seq技術，將免疫沉淀與抗5-甲基胞嘧啶抗體和DNA測序相結合，從4例PDAC患者和2例健康對照cfDNA中的70個基因中鑒定出143個高甲基化差異甲基化區域。在基因組數據庫(TCGA和GEO)中使用LASSO法對143個候選DMRs進行進一步分析，篩選出8個顯著區分PDAC患者和健康個體的標記物(TRIM73、FAM150A、EPB41L3、SIX3、MIR663、MAPT、LOC100128977和LOC100130148)，靈敏度為97.1%，特異度為98.0%。最后，Kaplan-Meier生存分析結果表明，這8個標志物可能作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物，但不能作為預后的指標。
Manoochehri及其合作者在2020年描述了SST基因在包括胰腺癌在內的各種腫瘤類型中的高甲基化和下調，作為泛癌癥分子生物標志物。結合對不同組織樣本進行全基因組DNA甲基化分析的DMRs和先前研究的表達譜數據，結果顯示SST是參與細胞增殖、侵襲、遷移、細胞死亡和凋亡以及胃腸道功能的唯一候選基因。通過RRBS測序、焦磷酸測序、qPCR以及對TCGA和GEO數據庫數據分析，對PDAC組織樣本中SST基因的高甲基化和低表達進行驗證，證明SST基因的高甲基化和表達具有預后價值，并與PDAC患者的生存率相關。此外，與Henriksen等人的觀點一致，在30例PDAC患者和18例健康對照的血漿樣本中，通過ddPCR對SST等位基因進行甲基化分析，結果顯示了較高的診斷靈敏度(93%)和特異度(89%)。然而SST甲基化仍不能作為胰腺癌的特異性標志物，而SST高甲基化極有可能作為廣泛腫瘤的血液泛癌生物標志物，用于初始分層為高危組和低危組。
Feng Cao等人于2020年開展了5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)測序和cfMeDIP-seq，以開發一種穩健且無創的方法，利用cfDNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5hmC標志物檢測PDAC。通過比較5mC和5hmC peaks分布，分別選擇了一組24個和27個5mC和5hmC peaks，這些peaks在訓練集和驗證集中能夠高精度地區分PDAC組和健康組。結合5hmC和5mC的綜合預測模型顯示出更高的預測靈敏度，尤其是在早期PDAC樣本中(綜合模型的靈敏度為87.5%，5mC和5hmC模型的靈敏度分別為75%和62.5%)，支持聯合應用循環游離5mC和5hmC生物標志物進行更準確的腫瘤診斷的可能性。
Majumder等人于2021年開始對他們之前通過RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)文庫在PDAC患者組織中鑒定出的13個甲基化DNA標志物進行血漿性能分析。使用TELQAS方法分析兩個獨立隊列的所有階段PDAC患者(170例)和無癌癥對照者(170例)的血漿樣本，包括GRIN2D、CD1D、CLEC11A、AK055957、ZNF781、PRKCB、FER1L4、HOXA1、RYR2、LRRC4、GH05J042948、SHISA9和NTRK3。I期、II期、III期和IV期的靈敏度分別為79%、82%、94%和99%，與CA19-9聯合檢測時，特異度和靈敏度分別高達94%和82%。這項工作代表了在PDAC患者中診斷性甲基化生物標志物組合的最大研究報告結果。然而，本試驗應納入慢性胰腺炎患者隊列，以增強上述組合的潛力。
Miller等人基于一項概念驗證研究，將ZNF154甲基化作為血液篩查多種癌癥(包括胰腺癌)的合適生物標志物。他們利用來自PDAC和無癌供體組織樣本的Illumina 450 K甲基化TCGA數據分析了ZNF154在特定CG位置的甲基化。此外，他們還使用cBioPortal從這些樣本中收集了突變數據。研究發現ZNF4在86.7%的PDAC樣本中呈高甲基化，而在常見的一組PDAC癌基因中有95.3%發生突變(KRAS中為90.7%，TP53、SMAD4或CDKN2A中為4.6%)。接下來，他們通過結合MOB和基于PCR的高分辨率DNA熔解方法(DREAMing)檢測了血漿樣本中14個ZNF154 CpG位點(包括Illumina CG位點)的甲基化狀態�？紤]到研究隊列較小(I-II期8例，III-IV期17例，正常對照組20例)，對晚期胰腺的靈敏度為94.1%，特異度為80% (AUC = 0.85)，對早期胰腺的靈敏度為100%，特異度為80% (AUC = 0.87)。此外，他們觀察到：(I)在早期樣本中未檢測到KRAS突變cfDNA；(II)晚期PDAC患者中KRAS突變等位基因頻率顯著高于對照組；(III) AUC為0.67。作者得出結論，ZNF154顯示出作為基于液體活檢的癌癥篩查實驗室檢測的良好潛力。建議未來使用更大的血漿樣本進行驗證，包括不同的癌癥類型和分期，并建議考慮將該標志物納入臨床試驗。
最后，利用cfDNA甲基化監測疾病進展和對治療的應答是胰腺癌中很少討論的一個重要方面。在這方面，Vrba和同事通過定量MSP分析9例轉移性PDAC患者治療前和治療后4周的血液樣本，測試了一種新的10個基因DNA甲基化標簽評估腫瘤療效的能力。雖然隊列和監測時間有限，但其結果顯示在所有接受治療的患者中，生物標志物信號均有統計學顯著下降。
本文作者最近的一項研究中使用ddPCR分析了44例轉移性PDAC患者血漿中NPTX2甲基化水平，以評估其在預后和監測疾病進展中的作用。驗證了循環NPTX2甲基化水平不僅可以作為有價值的預后生物標志物，而且可以作為監測轉移性PDAC患者的實用工具。因此，在mPDAC患者中，NPTX2甲基化水平的變化與疾病進展和治療反應之間存在相關性，在預測疾病進展方面優于CA19-9。此外，在許多情況下，循環NPTX2甲基化水平的升高先于CT成像發現疾病進展。
挑戰和結論
循環甲基化DNA有望成為胰腺癌檢測和治療的無創生物標志物。本文就液體活檢中DNA甲基化作為PDAC診斷或預后工具的最新研究進展進行綜述。
液體活檢領域(尤其是在處理cfDNA時)面臨的一個持續而緊迫的挑戰是迫切需要對技術進行標準化和臨床驗證。這對于從基礎研究過渡到臨床試驗范圍并最終推進該領域至關重要。分析的方法學程序和具體目標尚未完全標準化。因此，為了實現實驗室間的一致性，并建立一個或多個基因作為臨床適用的基于cfdna的胰腺癌表觀遺傳生物標志物，在大量的患者和健康個體隊列中進行驗證至關重要。此外，為了便于研究結果的比較，還需要統一鑒定和檢測技術，從而確保所開發方法的臨床可行性。
另一方面，使用單一生物標志物檢測到的表觀遺傳改變無法捕捉疾病的復雜生物學。從這個意義上說，多種生物標志物的聯合無疑可以提高預測能力，并有助于早期診斷、預測預后和治療反應。
目前已有47項臨床試驗研究cfDNA甲基化標志物在癌癥中的診斷和預后效用。其中9項研究是關于胰腺癌中甲基化血液循環生物標志物的驗證，而疾病的早期診斷是大多數(70%)研究的主要目的(圖2)，盡管沒有提供關于分析哪些基因的具體信息。
圖2：使用cfDNA甲基化治療癌癥的當前臨床試驗的圖形譜，以及基于cfDNA甲基化的胰腺癌試驗的臨床干預目標。
綜上所述，將循環游離DNA甲基化納入胰腺癌的臨床和精準醫學是一個前景光明的現實。為此，有必要共同努力，通過更精心設計的研究，結合靈敏度更強或創新技術的研究，以及增加大規模臨床試驗樣本數量，來驗證其療效和效用。最后，合作研究和資源共享也可為將這一創新方法納入臨床應用鋪平道路。
參考文獻：
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背景介紹（Introduction）
胰腺癌是發達國家死亡率第三高的腫瘤，也是3年生存率最低的腫瘤（5%）。胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常見的胰腺癌類型，占所有病例的80%以上。目前碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是胰腺癌臨床診斷中唯一常規使用的血液生物標志物，其靈敏度（79%）和特異性（82%）相對較低。轉移性PDAC患者的CA19-9水平與生存率之間存在關系。 在臨床實踐中，對于疾病過程中CA19-9水平變化的解釋尚未達成共識。
因此，開發基于血液的胰腺癌替代生物標志物勢在必行，這些生物標志物有助于早期診斷、精準分層、選擇適當的治療方案、監測治療反應、評估治療耐藥性、鑒定微小殘留病灶和復發風險。液體活檢是對循環血液成分中的分子生物標志物進行分析，已成為克服癌癥診斷和監測挑戰的一種有前景方法(圖1)。通過檢測和分析血液中循環游離DNA（cfDNA）、循環腫瘤細胞（CTC）和其他生物標志物的基因突變，液體活檢為評估腫瘤特征和監測治療應答提供了一種非侵入性方法。
在癌細胞中經常觀察到異常的DNA甲基化模式變化，這些變化可反映在血液循環中的cfDNA中。檢測血流中的這些甲基化變化有望用于早期癌癥檢測，并有可能通過及時干預改善結局。本文首先對cfDNA在胰腺癌中的研究進行回顧；然后分析了DNA甲基化在胰腺癌背景下的相關性，總結cfDNA甲基化的最新研究，特別強調其臨床效用；最后討論了cfDNA甲基化分析的未來方向、臨床轉化以及將其應用到常規臨床實踐中的可能性。
循環cfDNA作為胰腺癌的血液生物標志物
那些存在于血液中的DNA片段被稱為循環游離DNA (cfDNA)，cfDNA可來源于正常細胞更新、凋亡或壞死細胞以及腫瘤細胞等。在cfDNA中可以檢測到腫瘤特異性遺傳學變化，包括基因突變、微衛星不穩定性(MSI)、雜合性丟失(LOH)和異常甲基化模式。cfDNA大小為40~200個堿基對(bp)，peak值約為166bp，健康個體中cfDNA片段長度中位數比癌癥患者大。
與腫瘤組織活檢相比，cfDNA不僅更好地描述了腫瘤的完整情況，而且提供了重復采樣和分析的可能性，從而可以縱向評估cfDNA濃度的動態變化、鑒定獲得性耐藥突變和監測克隆進化。然而將cfDNA作為癌癥的血液生物標志物進行分析也有一些局限性。cfDNA診斷和預后效用的一個重要方面是其血漿低濃度，這使檢測和分析更為復雜化。據估計，每毫升血漿中約有10-15 ng cfDNA，在大多數早期癌癥中，循環腫瘤DNA只占cfDNA的一小部分。這些考慮突出了對超靈敏檢測方法的要求。最靈敏的方法是基于聚合酶鏈反應(PCR)方法，如BEAMing單分子PCR、TAm-Seq、數字PCR和微滴數字PCR。胰腺癌的cfDNA作為一種有前景的早期檢測和預后生物標志物受到越來越多關注。最近的研究表明，80%以上的轉移性胰腺癌患者中檢測到循環cfDNA的遺傳學變化，但僅在48%的局限性腫瘤患者中檢測到。
胰腺癌在雜合性缺失(LOH)情況下，對微衛星不穩定性(MSI)進行的液體活檢研究非常罕見或不存在。Chakrabarti等評估了使用Guardant360技術分析了循環腫瘤DNA中的MSI狀態可否預測PDAC患者對免疫治療的穩健應答。結果表明在83%的患者的組織MSI結果與血漿G360結果一致。此外，在1例患者的腫瘤組織中未檢測到MSI，而血漿中檢測到MSI。
胰腺癌中最常見的血液生物標志物研究包括對cfDNA循環突變分析，最常見的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4或FBXW7。這些突變與腫瘤中發現的突變同時發生，強調了cfDNA作為有價值的胰腺癌血液生物標志物的潛力。一些研究已經證實了在循環cfDNA中檢測到KRAS突變與局部晚期或轉移性PDAC患者的不良預后相關。此外，一些研究還將檢測循環cfDNA中的KRAS突變作為生物標志物，用于監測治療反應和鑒定胰腺癌耐藥的早期跡象。在最近的一項研究中，不可切除胰腺癌患者的cfDNA中存在KRAS突變與不良治療結果強相關，并提示這一分子評估可作為評估早期腫瘤進展的生物標志物。
目前的研究強調了cfDNA作為預測PDAC患者預后有價值的生物標志物來源潛力。在整個治療過程中，cfDNA基因圖譜變化可作為治療應答或耐藥的早期指標，從而為利用生物標志物進展來指導治療決策提供了一個有前景的途徑。
盡管如此，仍然迫切需要推進更靈敏技術的開發，這些技術能夠增強對腫瘤來源的循環DNA檢測，并提高預后預測的準確性。超靈敏技術結合和表觀遺傳標記(如cfDNA甲基化)的整合為提高胰腺癌cfDNA分析的靈敏度和特異性提供了一個有希望的機會(圖1)。
DNA甲基化與胰腺癌
近年來，試圖鑒定胰腺癌中甲基化標志物的研究越來越多。DNA甲基化可逆，從治療角度來看具有很高的研究價值。DNA甲基化在CpG二核苷酸胞嘧啶C5位點上添加或移除一個甲基(CH3)，CpG二核苷酸主要存在于CpG島的特定基因組區域中。在哺乳動物中，DNA甲基化模式構建主要由DNA甲基轉移酶3 (DNMT3)家族介導，包括DNMT3A和DNMT3B。一旦構建，這些模式隨后通過DNMT1作用來維持。在正常細胞中，正確DNA甲基化模式保證了基因表達的正確和精確調控，并維持穩定的基因沉默。因異常甲基化模式被廣泛認為是許多類型癌癥的表觀遺傳標志，通常在癌癥中觀察到低甲基化和高甲基化事件。具體來說，在基因缺失區域和重復序列中，甲基化CpG含量整體下降；從而導致基因組不穩定，激活先前沉默的致癌基因。癌癥常表現為基因啟動子的局部高甲基化，導致抑癌基因的轉錄沉默。
目前對胰腺組織活檢、細胞系或異種移植模型的大量研究來解讀胰腺疾病的特異性甲基化模式，以作為胰腺腫瘤的診斷或預后工具。在胰腺癌中，近80%的病例顯示DNMT1表達上調，導致高甲基化。高甲基化被認為是胰腺癌中最主要的異常表觀遺傳學改變。這種異常高甲基化的影響主要在腫瘤抑制基因中觀察到。CDKN2A/p16INK4是胰腺癌中第一個因啟動子異常高甲基化而失活的抑癌基因，它在抑制細胞周期由G1期向S期進展，確保細胞周期停滯中起著至關重要的作用。在胰腺外分泌和上皮內腫瘤新鮮冷凍組織、人胰腺癌細胞系和異種移植物中進行的其他研究表明，在胰腺癌中，細胞通過G1期進展的其他負調控因子，如細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑CDKN1C/p51KIP2和細胞周期蛋白CCND2的高甲基化和隨后的下調。在胰腺腫瘤中，由于異常高甲基化而導致表達降低的其他腫瘤抑制基因包括前腦腦肽原(PENK，在分析的93.3%的腫瘤樣本中高甲基化)、細胞因子信號轉導抑制基因1 (SOCS-1, 57.1%)、原鈣黏蛋白10 (PCDH10, 60.9%)、iroquois同源盒4 (IRX4, 64%)和reprimo (RPRM, 57%)等。
胰腺癌中除抑癌基因異常高甲基化外，某些基因也存在異常低甲基化。這種低甲基化主要發生在特定基因的啟動子區，導致其過表達，從而促進胰腺癌細胞的增殖、存活和侵襲。其中一個基因是絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINB5 (Maspin)。據報道SERPINB5基因在87%的胰腺癌細胞系(20/23)、94%的異種移植物(32/34)中完全未甲基化，在86%的原發性胰腺癌(6/7)中低甲基化，該基因甲基化與mRNA表達水平呈負相關。在臨床樣本中，未甲基化SERPINB5的存在已經證明了其作為胰腺腫瘤特異性生物標志物的潛力，使胰腺導管腺癌(PDAC)與胰腺炎的鑒別成為可能。通過將甲基化和表達譜數據相結合的多組學分析，有令人振奮的證據表明，在胰腺癌組織中，與低甲基化狀態相關的特定基因上調，包括磺基轉移酶家族1E成員1 (SULT1E1)、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白3 (IGF2BP3)和絲裂原活化蛋白4激酶4 (MAP4K4)。這些基因的甲基化和表達譜變化與胰腺癌患者的總生存期顯著相關，因此提示它們作為預后生物標志物的潛在效用。另外幾個基因在胰腺癌組織中因異常低甲基化而過表達，包括MUC4、CLDN4、LCN2、SFN、TFF2、S100A4、MSLN和PSCA。
此外，近年來，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)作為一種生物學功能尚不明確的氧化形式的5mC，作為癌癥診斷和生存的潛在生物標志物引起了極大的興趣。一些研究報道，5hmC水平在人類癌癥中顯著降低，胰腺癌被描述為導致游離細胞羥甲基化的疾病特異性變化。
綜上所述，表觀遺傳改變在胰腺癌的發生發展中起著關鍵作用。因此，對胰腺癌發生的異常表觀遺傳修飾進行綜合分析，對胰腺癌的分子診斷和治療監測具有重要意義。
胰腺癌cfDNA甲基化研究分析
對胰腺癌血漿中甲基化生物標志物的探索仍處于早期階段，迄今為此開展的研究數量有限。胰腺癌的cfDNA甲基化模式分析已在全基因組水平以及通過鑒定和描述單個基因或小基因panel來進行。關于全基因組測序方法，已經發表了多項研究。本文主要探究單個基因或小基因panel作為未來臨床應用的潛在生物標志物的效用 (表1)。首項關于鑒定血漿中胰腺癌甲基化標志物的研究始于2007年。Jiao等通過甲基化特異性PCR (MSP)檢測了83例未經治療的胰腺癌患者血漿樣本中ppENK和p16基因的甲基化狀態。ppENK和p16啟動子甲基化率分別為29.3%和24.6%。在83例患者中，9例成對的胰腺腫瘤組織切片在相同甲基化的腫瘤患者血漿樣本中，p16和ppENK基因的高甲基化率分別為60%和80%。作者得出結論，血漿DNA在檢測胰腺癌表觀遺傳學變化中可能具有替代腫瘤組織的價值。然而對于潛在診斷標志物而言，所獲得的靈敏度太低，這可能是由于分析的成對血漿/腫瘤樣本數量少。此外，本研究缺乏健康人和良性胰腺疾病患者組成的對照組數據。
表1：血漿/血清中游離DNA甲基化作為胰腺癌診斷和/或預后生物標志物的研究
此后不久，另一項開創性研究發表，表明可以通過使用血漿中循環cfDNA的甲基化譜來檢測胰腺癌。Melnikov等分析了30例PDAC患者和30例年齡匹配的健康志愿者的甲基化特征。當時引入了一種名為MethDet56的新技術，該研究使用了包含56個頻繁甲基化基因的芯片檢測panel。這一創新方法旨在通過甲基化靈敏的核酸內切酶消化標靶序列，然后使用PCR擴增未消化的片段，從而檢測標靶序列的甲基化水平。CCND2、PLAU、SOCS1、THBS和VHL等5個基因在PDAC患者血漿中的甲基化水平低于健康對照組，低甲基化模式的靈敏度為76%，特異性為59%。作者將這組基因歸類為復合生物標志物，從而確立了其對采用基于血漿的方法檢測胰腺癌的一致預測價值。此外，他們認為啟動子的非甲基化狀態在腫瘤檢測方面更有價值。然而這些發現尚未得到后續研究驗證，并且將血漿cfDNA中的低甲基化特定基因用作PDAC的生物標志物仍然是一個有爭議的話題。
同一研究小組使用他們開發的MethDet56方法，比較30例PDAC患者、30例慢性胰腺炎患者和30例健康對照者血漿cfDNA甲基化，每組年齡、性別和種族分布相似。為了確定血漿中的特異性甲基化譜，研究者選擇了8個含信息基因（informative genes ）(BRCA1、CCND2、CDKN1C、MLH1、近端和遠端PGR啟動子區、SYK和VHL)的啟動子，以區分慢性胰腺炎和健康對照(靈敏度為78%，特異性為81.7%)。當比較慢性胰腺炎和PDAC時，他們發現14個基因啟動子(CCND2、CDKN1C、CDKN2B、DAPK1、ESR1啟動子A、MGMT、MLH1、MUC2、MYOD1、PGK1、PGR啟動子近端區域、RARB、RB1和SYK)存在差異甲基化(90.8%靈敏度和91.2%特異性)。14個基因啟動子中有9個為慢性胰腺炎特異性啟動子，5個為兩組共有。在這組共有的5個基因中觀察到在慢性胰腺炎中高甲基化的基因在PDAC中低甲基化。
幾年后，MethDet56方法被用于研究PDAC和結直腸癌(CRC)是否在血漿cfDNA中的共有甲基化標志物。7個基因panel(MDR1、SRBC、VHL、MUC2、RB1、SYK和GPC3)被鑒定為區分CRC或PDAC與健康對照的最佳循環甲基化標簽。此外，一項該panel進行的限制性更強的分析結果表明，GPC3是有效區分PDAC和健康對照的唯一基因，而VHL和SRBC是PDAC和CRC的信息基因。
Park J.W.等在2012年發表了兩項研究，使用MSP技術在血漿中診斷胰腺癌。第一項是初步研究(16例胰腺癌患者，13例慢性胰腺炎患者和29例健康對照)，該研究使用了6個候選基因，這些候選基因基于Sato等人2003年在原發性胰腺癌和正常胰腺導管上皮中獲得的結果選擇。UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A基因啟動子在PDAC患者和健康對照之間存在差異甲基化，但p16基因啟動子在PDAC患者和慢性胰腺炎患者之間存在差異甲基化。慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危險因素，繼這些結果和之前從胰腺癌細胞學樣本中獲得結果之后，作者重點研究了一個更大的血漿隊列中NPTX2的甲基化狀態，該隊列包括104例PDAC患者、60例慢性胰腺炎患者和5例良性膽道結石患者。NPTX2甲基化在PDAC組中顯著升高(84%的PDAC患者，慢性胰腺炎和良性膽石病組分別為33%和0%;P = 0.016)，其靈敏度和特異性分別為80%和76%，且與腫瘤分期的惡化呈正相關。
Singh及其合作者于2020年分析了Park等2012年檢測的6種生物標志物中的3種(UCHL1、PENK和NPTX2基因啟動子)，并將SPARC基因加入研究。從61例PDAC患者、22例慢性胰腺炎患者和21名健康受試者的cfDNA中通過定量MSP (qMSP)獲得的絕對拷貝數計算基因甲基化指數(MI)。這4個基因在PDAC中的MI顯著高于健康對照組，SPARC MI能夠鑒別早期PDAC和慢性胰腺炎。此外，較高的UCHL1 MI與疾病的晚期相關；SPARC和NPTX2基因的高MI與PDAC的低生存率相關。
2013年，Kawasaki等利用MSP技術研究了不同類型癌癥患者（包括47名PDAC患者）cfDNA中細胞周期相關基因(APC、DCC、p16、p14、RASSF1A)的甲基化率。RASSF1A和APC的甲基化率最高，分別為34和23.4%，其次為p16和p14。然而本研究缺乏健康對照組，且RASSF1A甲基化百分比在其他類型的癌癥如肝細胞癌中相似甚至更高。
同樣在2013年，Yi等通過轉錄組微陣列對4種胰腺癌細胞系中獲得的1427個特異性基因進行癌癥特異性甲基化過濾后，通過MSP分析了8個候選基因的甲基化狀態。bbnc1和ADAMTS1啟動子基因在原發性PDAC腫瘤樣本中表現出最高的甲基化率(分別為91%和67%;n=123)和癌前胰腺上皮內瘤變(PanIN)樣本(分別為70%和25%;n=20)。然后使用甲基化磁珠(Methylation On Beads, MOB)方法在血清樣本(42例PDAC患者和26名健康個體)中驗證這些生物標志物，這是一種捕獲、保留和亞硫酸鹽處理微量DNA的納米技術。在I期PDAC樣本中，BNC1的靈敏度達到79%，ADAMTS1的靈敏度達到48%，這兩個基因的靈敏度均提高至90%。BNC1和ADAMTS1的特異度分別為89%和92%。結合這兩種基因，檢測極早期胰腺癌的靈敏度提高(81%)，但特異性未提高(85%)。
9年后，同一組研究人員通過qMSP方法在39例PDAC患者、95例匹配的年齡對照和8例慢性胰腺炎患者組成的獨立隊列中驗證了這組有前景的生物標志物。在87.2%和65.1%的PDAC病例中檢測到ADAMTS1和BNC1甲基化，而在非癌癥患者中分別檢測到4.2%和6.3%。兩基因組合(ADAMTS1和/或BNC1)改善了個體結果，在患者和對照中分別達到97.4%和8.4%的甲基化水平。該組合也在87.5%慢性胰腺炎樣本中顯示了甲基化，未能區分PDAC和慢性胰腺炎。在I期、IIA期、IIB期、III期和IV期胰腺癌患者中，ADAMTS1 / BNC1組合的cfDNA甲基化率分別為100%、88.9%、100%，將CA19-9納入分析后，未見明顯改善。根據這些結果，作者強調ADAMTS1和BNC1是在疾病初期階段cfDNA中早期檢測胰腺癌的可靠標志物，這為治愈性腫瘤切除術提供了治療機會。
2021年，為了提高診斷潛力，同一研究組將LRFN5和PXDN基因加入到ADAMTS1/BNC1聯合甲基化panel中。采用MSP法檢測106例FFPE組織樣本(44例PDAC (I-IV期)、15例PanIN、24例導管內乳頭狀黏液性腫瘤、15例慢性胰腺炎和8例非癌對照) 中的甲基化水平，并使用MOB和qMSP檢測32例血漿(22例PDAC (I-IV期)和10例健康對照)中甲基化水平。
將LRFN5/PXDN添加到生物標志物組中提高了癌前和早期癌癥檢測的診斷準確性，AUC為0.94。此外，在血漿中獲得的4個基因組的靈敏度和特異度分別為100%和90%。本研究納入的人群具有多樣性，增強了研究結果的廣泛適用性。血漿樣本量明顯小于腫瘤組織樣本量。作者認為，cfDNA中4基因組的甲基化頻率與組織中相當，盡管較低，可能是由于存在腫瘤異質性，這表明這些生物標志物基因對能夠血行擴散的腫瘤克隆至關重要。
Henriksen團隊采用了一種獨特的方法，專注于開發基于cfDNA甲基化的預測模型，用于胰腺癌診斷、生存預測和預后。2016年，Henriksen等人利用優化亞硫酸鹽處理方案和兩輪MSP和qMSP(外部和內部甲基化特異性引物和探針)評估了基于之前文獻的發現選擇的28個基因panel。共納入95例PDAC患者，其中慢性胰腺炎組97例，急性胰腺炎組59例，胰腺良性疾病組27例�；诙嘧兞縧ogistic回歸分析，建立了包含8個基因(APC、BMP3、BNC1、MESTv2、RASSF1A、SFRP1、SFRP2和TFPI2)的預測模型(年齡> 65歲)，該模型能夠成功鑒別良惡性病變，靈敏度為76%，特異度為83%。作者強調了這一預測模型與癌癥分期的獨立性，并得出結論，認為該模型有可能用作胰腺癌的早期血液診斷工具。
隨后，采用相同的28個基因組、相同的PDAC患者隊列和相同的實驗方法，只發現IV期高甲基化基因的平均數量有非常顯著的差異，但在I、II或III期則沒有，表明在癌癥發生和進展過程中，高甲基化啟動子區域有積累。他們開發了能夠區分IV期PDAC患者與無遠處轉移的患者(I、II和III期)，以及可能可切除的PDAC患者(I和II期)與不可切除的PDAC患者(III和IV期)的預后預測模型。
同樣在2017年，該研究組利用這一隊列建立了PDAC患者的生存率與血漿來源的cfDNA中高甲基化基因之間的相關性。作者發現，cfDNA中有10個以上高甲基化基因的患者生存率顯著較低，這些基因因胰腺癌分期而異。通過多變量Cox回歸分析建立的最終生存預測模型由5個基因(BNC1、GSTP1、SFRP1、SFRP2和TFPI2)和美國麻醉醫師協會(American Society of Anesthesiologists, ASA)身體狀態評分為3分(表明患者患有嚴重全身性疾病)組成。除SFRP2基因甲基化與較長的生存期相關外，其他基因甲基化均與較差的預后相關。在Henriksen及其同事所描述的三項研究中，高甲基化被作為定性二元變量進行分析，導致了定量信息的丟失。
2021年，這些研究者對他們之前發表的PDAC診斷預測模型(BMP3、RASSF1A、BNC1、MESTv2、TFPI2、APC、SFRP1和SFRP2)進行外部驗證，并研究了CA 19 - 9血清對診斷試驗預測性能的額外影響。對346例PDAC(I-IV期)和25例慢性胰腺炎患者的cfDNA樣本進行的初始28個基因panel的MSP結果顯示，與慢性胰腺炎患者相比，PDAC患者的高甲基化基因數量較高(8.11 vs. 5.60)。診斷預測模型驗證的AUC為0.77，略低于2016年的第一項研究(0.86)。作者解釋說主要研究是基于訓練數據，可能由于過度擬合而高估了測試表現，從而證明了這一差異。將該檢測與血清CA19-9值相結合，AUC為0.85(在主要研究中為0.93)，作者得出結論，這兩種標志物的聯合使用可以作為臨床上有用的PDAC診斷工具。重要的是要考慮到，除了在驗證分析中納入的對照個體數量少之外，病例和對照在年齡或吸煙方面不匹配，而這兩個因素都是影響甲基化狀態的重要因素。
Xiao-Bin Li等人于2019年對BNC1和SEPT9基因進行了重新分析，這些基因先前被描述為胰腺癌癥的潛在循環生物標志物。qMSP檢測結果顯示，在57名PDAC患者、14名PanIN病變患者、44名良性疾病患者和53名健康對照中，兩個基因的循環甲基化水平存在顯著差異，腫瘤患者組的甲基化水平更高。這些標志物與CA19-9聯合用于診斷癌癥的靈敏度和特異性分別為86%和81.1%。然而，這些標志物可能在大約1/3的良性胰腺疾病以及其他癌癥中（如結直腸癌癌癥、癌癥和肝細胞癌）發生甲基化。
2020年，Shinjo及其同事進行了Illumina Infinium全基因組DNA甲基化分析，靈敏度達到98%，并指出在有KRAS突變的胰腺癌組織中，ADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A和SPSB4是甲基化最高的基因。隨后使用了一種新型且靈敏的方法(MBD-ddPCR)富集偶聯甲基化CpG結合蛋白，并在血清樣本(47例PDAC患者和14例正常對照)中驗證了這5個標記基因的甲基化狀態。雖然在癌癥患者和對照之間未觀察到顯著差異，但49%的PDAC患者至少有一個基因甲基化，因此靈敏度為49%，特異度為86%。cfDNA甲基化狀態和KRAS突變聯合應用提高了診斷性能，靈敏度為68%，特異度為86%。一個懸而未決的問題是，如果將一組良性胰腺疾病患者納入研究，將如何比較cfDNA甲基化模式。
2020年，Li和同事使用MeDIP-seq技術，將免疫沉淀與抗5-甲基胞嘧啶抗體和DNA測序相結合，從4例PDAC患者和2例健康對照cfDNA中的70個基因中鑒定出143個高甲基化差異甲基化區域。在基因組數據庫(TCGA和GEO)中使用LASSO法對143個候選DMRs進行進一步分析，篩選出8個顯著區分PDAC患者和健康個體的標記物(TRIM73、FAM150A、EPB41L3、SIX3、MIR663、MAPT、LOC100128977和LOC100130148)，靈敏度為97.1%，特異度為98.0%。最后，Kaplan-Meier生存分析結果表明，這8個標志物可能作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物，但不能作為預后的指標。
Manoochehri及其合作者在2020年描述了SST基因在包括胰腺癌在內的各種腫瘤類型中的高甲基化和下調，作為泛癌癥分子生物標志物。結合對不同組織樣本進行全基因組DNA甲基化分析的DMRs和先前研究的表達譜數據，結果顯示SST是參與細胞增殖、侵襲、遷移、細胞死亡和凋亡以及胃腸道功能的唯一候選基因。通過RRBS測序、焦磷酸測序、qPCR以及對TCGA和GEO數據庫數據分析，對PDAC組織樣本中SST基因的高甲基化和低表達進行驗證，證明SST基因的高甲基化和表達具有預后價值，并與PDAC患者的生存率相關。此外，與Henriksen等人的觀點一致，在30例PDAC患者和18例健康對照的血漿樣本中，通過ddPCR對SST等位基因進行甲基化分析，結果顯示了較高的診斷靈敏度(93%)和特異度(89%)。然而SST甲基化仍不能作為胰腺癌的特異性標志物，而SST高甲基化極有可能作為廣泛腫瘤的血液泛癌生物標志物，用于初始分層為高危組和低危組。
Feng Cao等人于2020年開展了5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)測序和cfMeDIP-seq，以開發一種穩健且無創的方法，利用cfDNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5hmC標志物檢測PDAC。通過比較5mC和5hmC peaks分布，分別選擇了一組24個和27個5mC和5hmC peaks，這些peaks在訓練集和驗證集中能夠高精度地區分PDAC組和健康組。結合5hmC和5mC的綜合預測模型顯示出更高的預測靈敏度，尤其是在早期PDAC樣本中(綜合模型的靈敏度為87.5%，5mC和5hmC模型的靈敏度分別為75%和62.5%)，支持聯合應用循環游離5mC和5hmC生物標志物進行更準確的腫瘤診斷的可能性。
Majumder等人于2021年開始對他們之前通過RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)文庫在PDAC患者組織中鑒定出的13個甲基化DNA標志物進行血漿性能分析。使用TELQAS方法分析兩個獨立隊列的所有階段PDAC患者(170例)和無癌癥對照者(170例)的血漿樣本，包括GRIN2D、CD1D、CLEC11A、AK055957、ZNF781、PRKCB、FER1L4、HOXA1、RYR2、LRRC4、GH05J042948、SHISA9和NTRK3。I期、II期、III期和IV期的靈敏度分別為79%、82%、94%和99%，與CA19-9聯合檢測時，特異度和靈敏度分別高達94%和82%。這項工作代表了在PDAC患者中診斷性甲基化生物標志物組合的最大研究報告結果。然而，本試驗應納入慢性胰腺炎患者隊列，以增強上述組合的潛力。
Miller等人基于一項概念驗證研究，將ZNF154甲基化作為血液篩查多種癌癥(包括胰腺癌)的合適生物標志物。他們利用來自PDAC和無癌供體組織樣本的Illumina 450 K甲基化TCGA數據分析了ZNF154在特定CG位置的甲基化。此外，他們還使用cBioPortal從這些樣本中收集了突變數據。研究發現ZNF4在86.7%的PDAC樣本中呈高甲基化，而在常見的一組PDAC癌基因中有95.3%發生突變(KRAS中為90.7%，TP53、SMAD4或CDKN2A中為4.6%)。接下來，他們通過結合MOB和基于PCR的高分辨率DNA熔解方法(DREAMing)檢測了血漿樣本中14個ZNF154 CpG位點(包括Illumina CG位點)的甲基化狀態�？紤]到研究隊列較小(I-II期8例，III-IV期17例，正常對照組20例)，對晚期胰腺的靈敏度為94.1%，特異度為80% (AUC = 0.85)，對早期胰腺的靈敏度為100%，特異度為80% (AUC = 0.87)。此外，他們觀察到：(I)在早期樣本中未檢測到KRAS突變cfDNA；(II)晚期PDAC患者中KRAS突變等位基因頻率顯著高于對照組；(III) AUC為0.67。作者得出結論，ZNF154顯示出作為基于液體活檢的癌癥篩查實驗室檢測的良好潛力。建議未來使用更大的血漿樣本進行驗證，包括不同的癌癥類型和分期，并建議考慮將該標志物納入臨床試驗。
最后，利用cfDNA甲基化監測疾病進展和對治療的應答是胰腺癌中很少討論的一個重要方面。在這方面，Vrba和同事通過定量MSP分析9例轉移性PDAC患者治療前和治療后4周的血液樣本，測試了一種新的10個基因DNA甲基化標簽評估腫瘤療效的能力。雖然隊列和監測時間有限，但其結果顯示在所有接受治療的患者中，生物標志物信號均有統計學顯著下降。
本文作者最近的一項研究中使用ddPCR分析了44例轉移性PDAC患者血漿中NPTX2甲基化水平，以評估其在預后和監測疾病進展中的作用。驗證了循環NPTX2甲基化水平不僅可以作為有價值的預后生物標志物，而且可以作為監測轉移性PDAC患者的實用工具。因此，在mPDAC患者中，NPTX2甲基化水平的變化與疾病進展和治療反應之間存在相關性，在預測疾病進展方面優于CA19-9。此外，在許多情況下，循環NPTX2甲基化水平的升高先于CT成像發現疾病進展。
挑戰和結論
循環甲基化DNA有望成為胰腺癌檢測和治療的無創生物標志物。本文就液體活檢中DNA甲基化作為PDAC診斷或預后工具的最新研究進展進行綜述。
液體活檢領域(尤其是在處理cfDNA時)面臨的一個持續而緊迫的挑戰是迫切需要對技術進行標準化和臨床驗證。這對于從基礎研究過渡到臨床試驗范圍并最終推進該領域至關重要。分析的方法學程序和具體目標尚未完全標準化。因此，為了實現實驗室間的一致性，并建立一個或多個基因作為臨床適用的基于cfdna的胰腺癌表觀遺傳生物標志物，在大量的患者和健康個體隊列中進行驗證至關重要。此外，為了便于研究結果的比較，還需要統一鑒定和檢測技術，從而確保所開發方法的臨床可行性。
另一方面，使用單一生物標志物檢測到的表觀遺傳改變無法捕捉疾病的復雜生物學。從這個意義上說，多種生物標志物的聯合無疑可以提高預測能力，并有助于早期診斷、預測預后和治療反應。
目前已有47項臨床試驗研究cfDNA甲基化標志物在癌癥中的診斷和預后效用。其中9項研究是關于胰腺癌中甲基化血液循環生物標志物的驗證，而疾病的早期診斷是大多數(70%)研究的主要目的(圖2)，盡管沒有提供關于分析哪些基因的具體信息。
圖2：使用cfDNA甲基化治療癌癥的當前臨床試驗的圖形譜，以及基于cfDNA甲基化的胰腺癌試驗的臨床干預目標。
- 數據指的是47個臨床試驗中針對不同癌癥類型的67項研究。
- 數據指的是了9項胰腺癌臨床試驗中的13項不同終點的研究。
綜上所述，將循環游離DNA甲基化納入胰腺癌的臨床和精準醫學是一個前景光明的現實。為此，有必要共同努力，通過更精心設計的研究，結合靈敏度更強或創新技術的研究，以及增加大規模臨床試驗樣本數量，來驗證其療效和效用。最后，合作研究和資源共享也可為將這一創新方法納入臨床應用鋪平道路。
參考文獻：
García-Ortiz MV, Cano-Ramírez P, Toledano-Fonseca M, Aranda E, Rodríguez-Ariza A. Diagnosing and monitoring pancreatic cancer through cell-free DNA methylation: progress and prospects. Biomark Res. 2023 Oct 5;11(1):88.
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