中樞神經系統（CNS）是人體內結構和功能最復雜的系統。中樞神經系統的基本組織是神經組織，主要由神經元（神經細胞）和神經膠質細胞組成。神經元和神經膠質細胞以極其精妙和高度復雜的方式組合在一起，形成具有三維（3D）結構的系統。通過神經元或其他細胞之間復雜有序的連接，形成各種神經傳導通路和神經回路，控制和調節器官系統的功能活動，維持機體與外界環境的統一。

因此，對中樞神經系統的理解不能局限于單一類型的細胞或單個器官，而應基于多層次和多角度的多器官認識。細胞共培養系統的出現使得闡明體外神經細胞之間的相互作用和復制復雜的神經回路成為可能。共培養系統可用于研究：（1）細胞分化；（2）細胞的功能和活性；（3）細胞增殖和遷移；（4）中樞神經系統的發展；（5）代謝機制。

基于此，吉林大學基礎醫學院組織學與胚胎學系、病原生物學系課題組的一項研究曾綜述了與神經細胞相互作用相關的基于二維（2D）和3D共培養系統的體外模型，同時進一步討論了類器官共培養系統應用的最新進展，特別關注那些通過神經調節應用分析證明了明確相互作用的系統。
2D共培養模型在神經細胞相互作用研究中的應用

細胞共培養模型可用于觀察細胞之間或細胞與其周圍微環境之間的相互作用，可分為直接接觸共培養模型和間接接觸共培養模型。

直接接觸共培養是指將兩種或兩種以上的細胞按一定比例混合并在特定條件下接種在同一界面上。該系統最明顯的優勢是它可以證明神經膠質細胞和神經元細胞之間的相互作用。此外，還可以在共培養系統中添加額外的調節因子，如免疫細胞因子，以研究細胞間相互作用。

飼養層細胞共培養系統是將細胞接種在單層細胞（如顆粒細胞、成纖維細胞、輸卵管上皮細胞等）上的系統。這些飼養層細胞用有絲分裂阻斷劑（常用絲裂霉素）處理以抑制細胞分裂，但保留分泌生長因子的能力。基于兩種細胞類型的共培養，建立了由神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞組成的三重培養系統，該系統更真實地模擬了體內的神經炎癥反應，從而可以更好地了解細胞串擾對神經炎癥的影響。

間接接觸共培養是培養兩種或兩種以上不同的細胞類型，使細胞通過培養基內的化學因子相互作用，而沒有物理直接接觸。實現此目的的方法如圖1。例如，通過Transwell方法對施旺細胞（SCs）和神經元進行共培養表明，SCs分泌的β-細胞素可以影響神經元行為并增加突觸長度，從而促進神經再生。

從2D共培養條件獲得的數據可能具有與體內不同的結果，2D培養物中細胞的生長模式、形態和功能與體內生理條件下的細胞明顯不同。2D細胞培養中的異常細胞形態會影響細胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表達以及許多其他細胞過程。 圖1    實現間接接觸共培養的方法。（1）條件培養基：收集含有各種生長因子或細胞分泌刺激物的細胞培養上清液，以研究因子對細胞生長或分化的影響。（2）蓋玻片上的飼養層細胞：分泌某些因子的細胞也可以接種在蓋玻片上，以避免與接種在培養皿中的細胞直接接觸。（3）Transwell培養系統：Transwell室中的細胞共培養系統。

3D共培養模型在神經細胞相互作用研究中的應用

由于3D共培養系統模擬體內環境，因此為研究復雜的神經細胞相互作用提供了一種可靠的方法，例如各種神經細胞之間的協同和保護作用。3D共培養技術可以展示細胞活性和細胞間的分化、蛋白表達等反應，實現真實的細胞生物學和功能。在這里，研究將3D共培養系統分為基于細胞的3D共培養系統，基于組織切片的3D共培養系統和基于類器官的3D共培養系統（圖2）。 圖2    3D共培養模型在神經細胞相互作用研究中的應用：（1）不同類型的神經細胞在凝膠化后可以包裹成具有一定3D結構的水凝膠。（2）細胞可以與器官型切片共培養，保留了體外系統的主要優點。（3）可以開發基于類器官的共培養系統來研究涉及多個系統或組織的疾病過程。

基于細胞的 3D 共培養系統

為了構建模擬體內結構的3D結構，可以將神經細胞包裹到水凝膠中，凝膠化后具有一定的3D結構。天然和合成水凝膠都已用于3D系統的生物工程。

基底膠是一種天然水凝膠，對維持細胞生長、促進干細胞分化為神經元、促進軸突延伸等具有積極作用。除基底膠外，膠原蛋白水凝膠對神經譜系也有類似的作用。Yang等人報道，小分子和膠原蛋白水凝膠的聯合治療可以誘導原位內源性NSCs向神經元分化并恢復受損功能。另一種天然水凝膠，海藻酸鹽，也被用作構建3D細胞培養系統的潛在生物材料，因為藻酸鹽的結構類似于透明質酸，透明質酸是大腦ECM的主要成分。研究表明，包裹的人多能干細胞（hPSCs）衍生神經元粘附在水凝膠基質上并形成3D神經網絡。

最近的研究表明，天然材料，如基底膠和海藻酸鹽，可以設計和合成水凝膠復合材料，并開發用于制造具有孔隙或排列結構的支架。研究表明，水凝膠復合材料可以成為具有高導電性和生物相容性以促進神經再生的有前途的材料。脫細胞組織基質（DTM）是開發個性化臨床方法的另一種有前途的支架，并且在促進神經組織再生方面顯示出其獨特而有益的特征，特別是那些來自CNS的神經組織再生。

總之，水凝膠支架可以輕松支持3D神經細胞培養，這些支架是多孔的，有助于氧氣、營養物質和代謝物的運輸。因此，細胞可以在支架網絡內增殖和遷移，并最終粘附在支架網絡，然而，用這種技術獲得的球體的大小應該得到控制，因為一個大的3D球體會由于缺乏營養而引起中心壞死。

基于組織切片的 3D 共培養系統

組織切片保留了體外系統的主要優點，彌補了細胞系功能不足，并在一定程度上保持了組織的形態結構、組織活性和器官功能，從而提供了有利于神經分化和神經元回路的有利微環境。器官型切片的另一個優點是在其生理狀態下保存血管系統的3D排列。

器官型切片和共培養技術的結合對各種神經通路和疾病的模型特別有益。例如，在缺氧-葡萄糖條件下，海馬組織切片可用于模擬氧化應激引起的CNS損傷。成人全腦冠狀切片和膠質瘤干細胞（GSCs）的共培養可用于模擬膠質母細胞瘤腫瘤-宿主細胞相互作用，并研究多形性膠質母細胞瘤的治療。除了腦切片，脊髓切片還廣泛用于神經學研究，如神經修復和再生。在一項研究中，將大鼠脊髓切片與周圍神經移植物共培養，并給予不同濃度的米諾環素，以觀察其對運動神經元存活率的影響。這種共培養系統似乎是一個有用且有前途的模型，用于進一步研究驅動神經和內皮組織之間復雜相互作用的機制。

雖然基于切片的共培養系統提供了高度貼近人體的微環境，但仍存在一定的局限性，如組織切片的制作和操作過程復雜，需要相對精細的操作和經驗積累。此外，與其他體外培養物一樣，腦切片不能完全再現體內的生理環境。

基于類器官的 3D 共培養系統

一種新的來源于PSCs的3D模型，被稱為類器官，在神經發育建模、疾病機制分析和開發潛在療法方面具有很大的前景。類器官，如腦類器官和脊髓類器官，可以在體外復制神經發育，探索不同CNS區域之間的相互作用，探索人類CNS的進化及其獨特的調控機制。因此，可以開發基于類器官的共培養系統來研究涉及多個系統或組織的疾病過程，例如神經肌肉疾患（NMDs），肌萎縮側索硬化癥（ALS）以及不同CNS和局部回路之間的復雜連接。

2017年，Birney等人生成了一個人體3D微生理系統，其中包括功能整合的谷氨酸能和γ-氨基丁酸能（GABA）神經元，類似于背側或腹側前腦，以捕獲更復雜的發育過程。此外，融合區域特異性類器官，然后進行實時成像，能夠分析人類中間神經元遷移和整合，以模擬人類中間神經元遷移。最典型的基于類器官的共培養系統是腦-脊髓-骨骼肌組合，可用于模擬NMD。2019年，Lancaster的研究小組發表了在氣液界面培養腦類器官的方案，并成功利用腦類器官控制肌肉收縮。該系統不僅大大提高了神經元的成熟和存活率，而且侵入了腦類器官神經元的軸突來控制脊髓。通過控制脊髓，然后控制肌肉，不同CNS和局部回路之間的復雜連接在體外得以完美再現。

利用共培養系統建立微生物感染神經疾病模型

某些微生物（如病毒）可以穿過血腦屏障并進入中樞神經系統。因此，類器官可以與微生物共培養，以建立微生物感染的神經疾病模型。

寨卡病毒（ZIKV）是一種蚊媒病毒，成人感染通常較輕，而孕婦感染寨卡病毒可能導致新生兒小頭畸形。使用ZIKV感染的前腦類器官，Haddow等人觀察到與對照組相比，受感染的前腦類器官的大小顯著減小。這項研究表明，在進入胎兒大腦后，ZIKV感染神經前體細胞（NPCs）并引起細胞凋亡，在皮質發育中引起小的頭狀缺陷。除了揭示其機制外，ZIKV感染的腦類器官也可用于篩選治療ZIKV感染的藥物。

由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019年冠狀病毒病（COVID-19）會引起可能致命的呼吸道癥狀。然而，在腎臟、心臟、肝臟和大腦等其他器官也發現了損傷和功能障礙。越來越多的臨床證據顯示神經系統癥狀，尸檢結果也表明，一些患者的大腦中存在病毒。由于這些特征，腦類器官被廣泛用于研究病毒感染CNS的位置及其潛在靶標。研究表明，SARS-CoV-2病毒感染腦脈絡叢，可破壞腦類器官中的血腦屏障。另一項研究使用人iPSC衍生的單層腦細胞和區域特異性腦類器官來確定感染與炎癥反應和細胞功能缺陷有關。研究結果支持腦類器官為發現COVID-19神經精神并發癥的病理生理學線索和潛在治療選擇提供了一種有希望的工具。

總而言之，共培養系統，尤其是基于類器官的共培養系統，是控制和分析細胞相互作用的強大工具和技術。然而，類器官模型是人體組織實驗研究中的最新技術。與傳統模式相比，仍處于探索階段。其穩定性、可重復性、可擴展性以及如何精確控制微環境條件已成為類器官共培養技術發展中需要克服的問題。這些努力大多仍然是原則證明，而不是現有模式的充分發展和廣泛適用的替代辦法，具有固有的優勢和局限性。為了創建用于細胞相互作用研究的相關共培養系統，需要將類器官模型與標準化微設備相結合。


參考文獻：Liu R, Meng X, Yu X, Wang G, Dong Z, Zhou Z, Qi M, Yu X, Ji T, Wang F. From 2D to 3D Co-Culture Systems: A Review of Co-Culture Models to Study the Neural Cells Interaction. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13116. doi: 10.3390/ijms232113116. PMID: 36361902; PMCID: PMC9656609.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36361902/

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