期刊：Nature Communications
影響因子：16.6
伯豪技術(shù)服務(wù)：mRNA檢測

導讀
胃癌（GC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其轉(zhuǎn)移速度快，死亡率高。迫切需要GC的診斷標志物和潛在的治療靶點。究發(fā)現(xiàn)ACTL6A對于調(diào)節(jié)谷胱甘肽 (GSH) 代謝途徑至關(guān)重要,它上調(diào)γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基 (GCLC) 的表達，從而降低活性氧 (ROS) 水平并抑制鐵死亡。機制研究表明，ACTL6A作為核因子(紅細胞衍生2)樣2 (NRF2)的共轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)GCLC，且ACTL6A的疏水區(qū)起重要作用。本研究數(shù)據(jù)強調(diào)了 ACTL6A 在 GC 中的致癌作用，并表明抑制 ACTL6A 或 GCLC 可能是 GC 的潛在治療策略。

研究技術(shù)
mRNA microarray、LC-MS、CHIP-seq

研究設(shè)計圖

2. ACTL6A通過重編程GSH代謝以促進胃癌惡性進展
ACTL6A-KD SNU638細胞mRNA芯片結(jié)果表明ACTL6A的表達與信號通路之間的關(guān)聯(lián)，其中GSH代謝是相關(guān)性最高的途徑之一(Fig 2a)，GC 數(shù)據(jù)集 GSE15459 和 GSE27342也有相同的結(jié)論(Fig 2b-c)。GSH通過GSH/GSSG循環(huán)保護癌細胞免受氧化應(yīng)激，降低細胞內(nèi) ROS 水平并將 NADPH 轉(zhuǎn)化為 NADP+（Fig 2d），并用ACTL6A-KD細胞驗證了這一結(jié)果(Fig 2e-f)。DCFH-DA 結(jié)果表明，ACTL6A-KD細胞是否經(jīng)過H2O2 處理都有較高的ROS 水平（Fig 2g）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（NAC），可以重建ACTL6A-KD細胞增殖（Fig 2h-i）。NAC治療恢復了ACTL6A-KD PDO的囊狀結(jié)構(gòu)（Fig 2j）。GC異種移植小鼠結(jié)果表明，ACTL6A-KD顯著抑制腫瘤生長，NAC治療又顯著逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（Fig 2k-n）。
 

3. ACTL6A 抑制 GC 細胞鐵死亡
為了確定 ACTL6A 是否抑制 GC 細胞的鐵死亡，作者在ACTL6A消融的細胞中通過鐵死亡抑制(Fer-1)處理，細胞活力顯著恢復（Fig 3a），還觀察到ACTL6A敲低使GC細胞對H2O2、erastin和BSO敏感（Fig 3b-f）。鐵死亡的一個標志是脂質(zhì)過氧化物的積累，作者對ACTL6A-KD的細胞進行了C11-BODIPY染色，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化水平升高，并且在用erastin處理的細胞中這種表型更加明顯，并且可以通過Fer-1處理來改變（Fig 3g），此外，F(xiàn)er-1處理緩解了ACTL6A-KD誘導的PDO生長抑制，并使類器官恢復囊狀結(jié)構(gòu)（Fig 3h）。通過對異種移植腫瘤組織進行免疫組織化學 (IHC) 染色，發(fā)現(xiàn) ACTL6A-KD會顯著降低增殖標記物 Ki67 的水平，并增加增殖標記物 4-HNE的水平（Fig 3i）。
 

4. ACTL6A 通過上調(diào) γ-谷氨酰-半胱氨酸合成來影響 GSH 從頭合成
通過LC-MS評估ACTL6A調(diào)節(jié)GSH代謝的機制，研究C13-glucose的代謝去向(Fig 4a)。但是，結(jié)果未觀察到C13-glucose對谷氨酸、絲氨酸或甘氨酸的總貢獻發(fā)生顯著變化（Fig 4b-d）。同位素實驗表明，GSH的水平在表達 ACTL6A-KD的細胞中減少（Fig 4e-f）。此外，作者還研究了C13-glutamine的代謝去向，它是通過GSH從頭合成產(chǎn)生含有5個13C原子的γ-GC和GSH（Fig 4g）, C13-glutamine對谷氨酸鹽總貢獻未發(fā)生顯著變化（Fig 4h）。同位素實驗也驗證了這結(jié)論（Fig 4i-j）。
 

5. ACTL6A在調(diào)控GCLC
ACTL6A-KD抑制了異種移植組織中GCLC的表達(Fig 5a)，敲降后過表達GCLC，逆轉(zhuǎn)了對細胞增殖的抑制(Fig 5b)。DCFH-DA染色檢測，GCLC過表達恢復了敲降A(chǔ)CTL6A的細胞的ROS水平，并被NAC逆轉(zhuǎn)(Fig 5c)。C11-BODIPY染色表明，GCLC過表達恢復了細胞的脂質(zhì)過氧化水平，在Erastin處理時表型仍然顯著，而Fer-1逆轉(zhuǎn)（Fig 5d)。
 

6. ACTL6A通過NRF2在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GCLC
為了探索ACTL6A如何調(diào)控GCLC，作者通過對GC細胞中內(nèi)源性ACTL6A進行CHIP-SEQ分析，在GCLC的轉(zhuǎn)錄起始點附近有一個顯著的峰(Fig 6a)。Chip-seq結(jié)果表明，在GCLC的TSS附近的峰中，有一個序列與NRF2結(jié)合基序高度同源(Fig 6b)，作者推測ACTL6A可能與NRF2協(xié)同作用來調(diào)節(jié)GCLC的表達。熒光報告實驗驗證了NRF2和GCLC的相關(guān)性。用CHIP和qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)ACTL6A和NRF2都與GCLC TSS附近的預測結(jié)合位點相互作用(Fig 6d-e)。
 

7. ACTL6A 的 HR 結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡{(diào)節(jié) GCLC 和鐵死亡至關(guān)重要
構(gòu)建四種缺失突變體并轉(zhuǎn)染至ACTL6A-KD細胞中（Fig 7a）,發(fā)現(xiàn)野生型（WT）ACTL6A和ΔDNBL、ΔCC和ΔNBC ACTL6A突變體逆轉(zhuǎn)了敲低ACTL6A表達引起的細胞增殖抑制和GCLC蛋白表達減少，但ACTL6A HR缺失突變體沒有表現(xiàn)出這一點恢復效果（Fig 7b-c），增加ACTL6A ΔHR缺失突變體的劑量未能逆轉(zhuǎn)GCLC mRNA表達的減少（Fig 7d）。緊接著，進行了co-IP，發(fā)現(xiàn)ACTL6A ΔHR突變體不與NRF2結(jié)合（Fig 7e）。CHIP測定表明，與 （WT） ACTL6A 相比，ACTL6A ΔHR缺失突變體對 NRF2 與 GCLC 啟動子的結(jié)合沒有表現(xiàn)出恢復作用（Fig 7f ）。之后進行DCFH-DA 和 C11-BODIPY 染色實驗，發(fā)現(xiàn)（WT） ACTL6A 逆轉(zhuǎn)了 ROS 水平和脂質(zhì)過氧化水平的增加，相反，ACTL6A ΔHR缺失突變體并沒有逆轉(zhuǎn)這些高水平（Fig 7g-h）。
 

8. ACTL6A-GCLC-GSH 代謝軸與 GC 細胞鐵死亡的臨床相關(guān)性
為了確定 ACTL6A 在患者來源的PDX模型中調(diào)節(jié) GCLC 和抑制鐵死亡的臨床相關(guān)性，對ACTL6A 進行免疫印記分析（Fig 8a），進行異種移植，然后注射GCLC抑制劑BSO給小鼠（Fig 8b）。BSO可以減弱腫瘤進展，相反，GCLC抑制對ACTL6A表達低的PDX腫瘤的生長影響最小（Fig 8c-f）。PDX腫瘤冰凍切片進行DCFH-DA和C11-BODIPY染色檢測發(fā)現(xiàn)，ACTL6A高表達的PDX腫瘤的ROS水平和脂質(zhì)過氧化水平較低，而BSO處理后則顯著升高（Fig 8g-j）。通過LC-MS研究N15-glutamine在體內(nèi)的代謝命運，它通過GSH從頭合成產(chǎn)生含有一個N15原子的GSH肽（Fig 8k），并對高表達ACTL6A的PDX腫瘤施用BSO降低了總GSH水平（Fig 8l）,N15-glutamine對GSH的總貢獻減少（Fig 8m），BSO處理降低了GSH/Gln的比率（Fig 8n）。Kaplan-Meier分析表明，高 ACTL6A 和 GCLC 水平與較差的總體生存率相關(guān)（Fig 8o）。值得注意的是，GCLC 表達與 GC 中的 ACTL6A 顯著正相關(guān)（Fig 8p )。
 

參考文獻:
Yang Z, Zou S, Zhang Y, Zhang J, Zhang P, Xiao L, Xie Y, Meng M, Feng J, Kang L, Lee MH, Fang L. ACTL6A protects gastric cancer cells against ferroptosis through induction of glutathione synthesis. Nat Commun. 2023 Jul 13;14(1):4193. doi: 10.1038/s41467-023-39901-8. PMID: 37443154; PMCID: PMC10345109.