動物活體成像技術主要包括生物發光與熒光發光兩種技術。生物發光是利用熒光素酶基因標記DNA，通過基因表達產生的蛋白酶與相應底物發生化學反應產生光信號（圖1）。熒光發光采用熒光物質或熒光物質標記的抗體、納米材料、藥物等導入到活體體內，通過外界激發光源激發獲取成像。
 

圖1 生物發光活體成像檢測原理

通過活體成像技術可以觀測活體動物體內腫瘤的生長和轉移、炎癥的發生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學過程。前期小愛介紹了兩種活體發光成像技術在科學研究中的應用案例，我們可以根據自己的實驗需求結合技術的優缺點（表1）選擇合適的體內發光技術。

表1 生物發光與熒光發光成像技術優缺點

本期小愛以生物發光成像實驗為例帶大家一起學習動物活體成像實驗具體操作流程。

一個完整的生物發光活體成像過程包括構建熒光素酶重組質粒、細胞轉染和篩選、熒光素酶活性鑒定陽性克隆，再將陽性克隆細胞移植到體內建立動物模型，進而通過小動物活體成像系統檢測動物體內特定部位發出的熒光信號。最后取出腫瘤組織，通過染色進行病理形態學分析。

含熒光素酶的重組質粒根據實驗需求可以自己實驗室構建，也可以來源于其它實驗室惠贈或市售。

常用的細胞轉染方法是化學轉染法，對于一些較難轉染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等），可以使用轉染增強劑聚凝胺(abs42025397)來提高轉染效率。按照轉染試劑盒說明書的操作步驟進行轉染即可。

為篩選穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素最低濃度，可以通過建立殺滅曲線來實現，我們以G-418(abs44062790)最佳篩選濃度的確定為例。

1）第一天：處于對數生長期的未轉染的細胞按照20-25%的細胞密度（對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量）。鋪在合適的培養板上，37℃，CO2培養過夜；

2）根據細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL；

3）第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度G-418的培養基。每個濃度做三個平行孔；

4） 接下來每3-4天更換新的含G-418的培養基；

5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的最低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

篩選的單一抗性克隆傳代至第五代時用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

需要注意的是，篩選的陽性克隆細胞數理論上應與發光強度具有線性相關性，并且陽性克隆細胞應和未轉染的細胞具有相似的生長趨勢。因此，我們在確定陽性克隆細胞系后可以增加這兩個驗證實驗以確保整個實驗的完整性和可靠性。

篩選陽性克隆細胞株后，通常需要將細胞注射到動物體內構建模型，通過體內成像觀察腫瘤的發生和發展。但是也需要根據腫瘤類型和研究目的，選擇最適合的模型。一般腫瘤細胞的注射方式包括以下幾種：

表2 常用腫瘤細胞注射方式

小愛以裸鼠皮下移植瘤模型的建立為例，具體實驗步驟如下：

病理形態學觀察常見的染色方式有HE、IF、IHC、mIHC等，染色原理及作用如表3，可以根據實驗需求選擇合適的方法進行染色分析。值得注意的是，隨著科學家對疾病的深入探究，越來越多的科研學者更傾向于mIHC染色技術，而且發表的文章影響因子相對較高。

動物活體成像觀察結束后，脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm，按照試劑盒說明書的操作步驟經染色后觀察組織細胞的病理形態。

表3 HE、IF、IHC、mIHC染色方法的區別

（注：本文來源于文獻總結，僅供參考）

活體動物光學成像技術讓研究人員能夠觀察活體動物體內的基因表達和細胞活動，是將分子及細胞生物學技術從體外研究發展到活體動物體內的強有力手段，該技術推進了人們對各種生命活動、疾病過程的深入認識，正在被越來越廣泛地應用于生物學及醫學研究領域。