期刊：Cell Metabolism
影響因子：29
伯豪生物產品服務：伯優^®組織樣本懸液制備試劑盒、單細胞轉錄組測序服務

研究背景
在不利環境條件下，胚胎發育可能會可逆地停止，這一過程被稱為滯育。最近有研究表明，腫瘤細胞可以降低藥物的毒性，通過類滯育的現象，降低腫瘤細胞的凋亡死亡率。另有報告稱，當結直腸癌（CRC）細胞受到細胞毒性藥物治療時，它們會進入一種類滯育的狀態。而這些類滯育的癌細胞（DLCC）與沒有基因突變的癌干細胞不同，化療期間復發性腫瘤的克隆復雜性不會消失。然而，關于癌細胞向類滯育狀態（緩慢增殖和對化療耐藥）轉變的分子機制以及建立這些細胞的生物標志物譜尚需進一步的研究。

研究目的
為了探究DLCCs的基因特征，研究鑒定了各種滯育相關條件（包括營養剝奪和化療）之間共同變化的基因，并將它們與真正的胚胎滯育基因相結合。這種方法表明，在滯育轉換過程中，結構維持染色體4（SMC4）的下調是一個常見事件。之前的一項腫瘤學研究表明SMC4的下調在基因組不穩定性中起作用，表明其下調是CRC進展的驅動因素。因此，本文使用CRC作為模型系統，旨在揭示SMC4下調在滯育轉換中的功能意義。

研究結果
1. SMC4被鑒定為CRC中類滯育狀態的負調節因子
目前已發表的滯育的研究中，鑒定出的相關基因數量相對較多，無法進行經驗分析，因此本研究假設進一步細化滯育特征有助于鑒定導致癌細胞切換到滯育類狀態的關鍵基因。由于血清和葡萄糖剝奪是誘導胚胎干細胞滯育的一種方法，研究者調查了HCT116人CRC細胞在去除血清和葡萄糖后引起的轉錄組變化。此外，鑒于滯育是一種保守過程的概念，研究者還整合了小鼠滯育胚胎的分析。
 

通過對個別數據集與由Rehman等定義的110個“胚胎滯育下調”特征集進行基因集合富集分析(GSEA)，結果顯示HCT116和小鼠胚胎數據集均顯著富集，并且該特征基于的DTP數據集也顯著富集。這表明這三個數據集中共同變化的基因可能代表了滯育的關鍵介質。

在此基礎上，研究者對這三個數據集中差異基因的交集進行分析。通過系列實驗，發現SMC4的下調是所有實驗系統中唯一一致的變化。因此，該研究的后續的研究工作重點放在了探討SMC4在癌癥休眠中的作用。

之后，研究者在HCT116細胞中沉默了SMC4，并評估轉錄組的變化。經GSEA分析顯示，SMC4敲低顯著富集了胚胎停滯下調基因的變化。
 

此外，沉默SMC4顯著抑制了HCT116細胞在2D和3D培養中的增殖。
 

同時，研究者在患者和實驗性結腸腫瘤組織中觀察到增殖標記物Ki67和SMC4的染色之間的定量測量和空間分布的存在相關性。
 

使用HCT116細胞的實驗發現，使用短發夾RNA（shRNA）沉默SMC4導致伊立替康的IC50值顯著增加，而重新表達SMC4可逆轉細胞對化療藥物的不敏感。
 

然后，使用HCT116衍生的小鼠異種移植物進行了在體研究。然而，考慮到在SMC4沉默后觀察到的對細胞生長的抑制作用，我們采用了強力霉素誘導的TET-On系統，該系統可以在腫瘤形成后進行敲除。實驗結果發現，腫瘤形成后10天開始進行SMC4敲低會抑制腫瘤的生長。然而，結合伊立替康治療，SMC4基因敲除的腫瘤生長速度明顯快于對照組腫瘤，表明SMC4基因敲除的腫瘤對化療失去了敏感性。重要的是，去除SMC4基因敲除腫瘤中的強力霉素后，它們對伊立替康的敏感性得以恢復，這表明與SMC4缺失相關的生長抑制效應是可逆的。
 

2. DLCCs中糖酵解和乳酸的增加促進了其對化療的不敏感性
為了探索滯育樣細胞是否在體內發生，研究者對MC38腫瘤進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。該測序分析中包含9618個轉錄組，對應于4種主要細胞類型，即癌癥細胞、淋巴細胞、成纖維細胞和巨噬細胞。SMC4主要在快速循環的癌癥細胞中表達，說明其與增殖相關。與其他慢循環細胞相比，對反應缺氧環境的慢循環腫瘤細胞顯示出最低的SMC4表達。從測序結果中還發現，該細胞群體具有最高的糖酵解評分和最低的胚胎滯育下降特征評分，這表明低SMC4表達的DLCCs的的糖酵解反應顯著增強。
 

另外，研究發現標志性的糖酵解途徑在SMC4沉默的HCT116細胞的GSEA分析中顯著富集。此外，針對所有主要糖酵解酶的蛋白質印跡結果顯示，SMC4沉默與己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶、肝臟（PFKL）和醛縮酶C（ALDOC）的表達增加以及PGAM1的降低有關，而與其他糖酵解酶類沒有顯著變化。為了進一步驗證這些變化足以改變糖酵解通量，研究通過Seahorse XF測量了細胞外酸化率（ECAR）作為衡量糖酵解通量的標準。結果發現，HCT116和RKO結腸癌癌癥細胞中SMC4的敲低與糖酵解測量的增強有關。與這些發現一致，SMC4沉默后，葡萄糖利用率以及細胞外和細胞外乳酸水平增加。乳酸是葡萄糖厭氧分解的產物，也有文獻指出了其在增強癌癥細胞對化療的不敏感性中的作用。為了驗證SMC4敲低誘導的滯育樣細胞的藥物不敏感性是否與乳酸產生有關，用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）或乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑草酸鈉，處理HCT116細胞，以阻斷細胞乳酸產生。結果發現，草酸鹽處理降低了對照組和SMC4沉默細胞對伊立替康敏感性的差異，而2-DG完全消除了這種差異。
 

因為化學敏感性的變化在體內環境中最為相關，所以該研究使用異種移植物模型來驗證這些發現。與對照組相比，SMC4沉默的腫瘤的生長潛力降低，但對伊立替康的不敏感性明顯增加。此外，盡管單獨用2-DG治療不會影響對照或SMC4沉默的腫瘤的生長，但用2-DG和伊立替康聯合治療可以逆轉SMC4沉默的腫瘤表現出的藥物不敏感性。相反，在伊立替康治療后，SMC4沉默的腫瘤顯示出更高的增殖率，但與2-DG聯合治療抵消了這一優勢。從這些實驗結果可知，糖酵解的變化和乳酸的增加對SMC4沉默的滯育樣表型具有重要的功能性影響，因此后續的實驗進一步探究了乳酸在其中的作用。
 

3. 組蛋白乳酸化促進DLCC中ABC轉運蛋白的增加
目前有關乳酸鹽的研究，已經發現其作為組蛋白中賴氨酸殘基乳酸化的前體的重要意義。由于SMC4沉默細胞對化療的不敏感性依賴于乳酸鹽，因此，改研究嘗試評估這種表型是否由組蛋白乳酸化的變化引起。首先，研究確認了CRC組織中存在具有高糖酵解、低增殖特征的細胞，其中糖酵解水平是由乳基化賴氨酸殘基的泛特異性抗體（Klac）來衡量的。同時，使用Klac的初步分析顯示，在SMC4沉默后，細胞裂解物中的乳酸化水平大量增加。靶向組蛋白H3或H4的位點特異性抗體證實了這些變化，觀察到其對H4K8la、H4k12la和H3K14la的反應活性增加，其中H4k12a的后一種變化最為顯著。根據這一發現，研究采用CUT&Tag技術來分析H4k12la修飾的全基因組變化。結果發現，檢測到的峰值分布的顯著變化與SMC4沉默有關，整個基因組的信號顯著增加，并且集中在轉錄起始位點（TSS）附近。
 

此外，GSEA分析顯示，SMC4沉默顯著富集了KEGG“BC轉運蛋白途徑”中的基因變化，相關的ATP驅動的泵蛋白在調節腫瘤藥物流出和治療耐藥性中中起到重要作用。而為了確認H4K12la的變化是否是增強特定ABC轉運蛋白轉錄的原因，研究者考慮了ABC轉運蛋白基因的亞群，這些基因在SMC4沉默后表現出不同的H4K12a啟動子峰以及表達水平的改變。在已鑒定的候選基因中，qPCR分析證實了三個候選基因ABCC2、ABCC3和ABCC10，在SMC4缺失后均顯著增加。同時，使用免疫沉淀（ChIP）法對ABCC2、ABCC3和ABCC10中H4K12la修飾水平的分析同樣證實了，在SMC4沉默后，所有基因啟動子都表現出H4K12a信號的顯著增加。因此，ABCC2、ABCC3和ABCC10中H4k12la修飾的增加與其表達的增加有關。而為了證實乳酸和ABC基因調控之間的因果關系，后續的研究對乳酸水平進行了人為的增加或降低。實驗表明，用外源性乳酸鹽或丙二醇酮處理細胞提高了乳酸鹽水平，會顯著增加了ABCC2、ABCC3和ABCC10的表達，而使用2-DG或草酸鈉抑制細胞內乳酸鹽的產生則會降低了它們的表達。綜上所述，高乳酸水平有助于驅動ABC基因表達。最后，鑒于ABC轉運蛋白與癌癥細胞對化療的敏感性之間存在密切關系，該研究又通過，加入ABCC2抑制劑丙酸，成功逆轉了SMC4沉默細胞對伊立替康的不敏感性，證實了藥物流出有助于類滯育CRC細胞的耐藥性。
 

4.DLCCs中的細胞分裂失敗和多倍體是通過減少F-肌動蛋白組裝引起的
在SMC4敲低誘導的DLCCs中，隨著細胞大小和多倍體細胞存在的增加，也會產生表型上變化。這些變化在HCT116細胞的圖像中不太明顯，但在RKO和MC38細胞中很明顯。與沒有多倍體的區域相比，CRC組織中的多倍體細胞群體似乎也表現出較低的SMC4表達水平。由于多倍體通常是由胞質分裂失敗引起的，研究又對SMC4沉默是如何影響這一過程的進行了探索。為了確認SMC4是否影響收縮環的形成，研究者對分裂細胞中F-肌動蛋白和肌球蛋白II分布進行了觀測，發現SMC4沉默的細胞，收縮環形成失敗，染色區域集中在分裂細胞核附近，但不在分裂細胞核之間聚集。使用檢測活細胞中F-肌動蛋白的lifeact探針進行的替代分析表明，SMC4沉默的細胞未能進行胞質分裂，這與F-肌動蛋白的異常分布有關。
 

已有研究指出，PGAM1通過與α-肌動蛋白2（ACTA2）結合以增加F/G-肌動蛋白比率，在促進F-肌動蛋白組裝中發揮非酶促作用。而該研究發現，PGAM1的過表達可以促進對照細胞中F/G-肌動蛋白比率的顯著增加，并且與SMC4沉默相結合，可以在很大程度上逆轉F/G-肌動蛋白比例的降低以及多倍體的增加。同時，該研究也證實了異位表達的PGAM1可以部分補償SMC4沉默引起的細胞增殖能力下降。這些結果表明，伴隨SMC4敲低而來的PGAM1表達降低，通過其對胞質分裂的非酶作用，有助于產生類滯育表型。
 

5. 抑制SMC4會增強原位小鼠模型對化療的不敏感性
接著，本研究又從胚胎發生和腫瘤發生的雙重角度來探究SMC4在體內的意義及其與細胞滯育的關系。首先，研究者利用CRISPR-Cas9技術破壞了小鼠中的SMC4轉錄本，并猜想SMC4的大規模缺失可能導致胚胎死亡。而后續結果驗證了此猜想，Smc4+/-雜合小鼠之間的交配未能產生Smc4-/-純合小鼠，而且雜合小鼠的產生頻率也低于預期的Men-delian頻率。這表明SMC4缺失存在一定程度的單倍充足性，但確切原因尚不清楚。然后，本研究還測試了SMC4在主要器官中的表達水平，包括結腸、脾臟和肝臟。實驗發現，SMC4在SMC4+/-小鼠的器官中的表達較低。然而，對有活力的Smc4+/-小鼠的體重跟蹤顯示，與野生型同窩出生的對照組相比，沒有差異。此外，雜合小鼠沒有表現出明顯的異常，例如，Smc4+/-小鼠和野生型同窩小鼠的結腸長度沒有顯著變化。
 

然后，研究者將這些小鼠與偶氮乙烷（AOM）/右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的CRC模型相結合，試圖發掘SMC4表達對腫瘤發生和化療反應的影響。結果在腫瘤發生中觀察到了顯著的變化，其中Smc4+/-小鼠的遠端結腸腫瘤的數量和大小顯著少于野生型同窩出生的小鼠，并且Smc4+/-腫瘤組織含有明顯較少比例的有絲分裂癌癥細胞。然后，該研究又進一步揭露了SMC4的減少是如何影響伊立替康作用的。研究發現，伊立替康的治療顯著抑制了腫瘤的發生，但Smc4+/-腫瘤組織的生長速度明顯快于野生型同窩出生的腫瘤，這表明Smc4+/-腫瘤對化療的敏感性降低。Smc4+/-和Smc4+/+腫瘤中糖酵解酶表達的比較顯示，與細胞系實驗中觀察到的變化一致，腫瘤組織中的HK2和PFKL增加，PGAM1水平降低。
 

研究總結
本文揭示了SMC4在結直腸癌細胞向類滯育狀態切換過程中的多種作用。SMC4減弱可促進糖酵解酶的表達，增加乳酸的產生，同時抑制PGAM1。由此產生的高乳酸水平通過組蛋白乳糖基化增加ABC轉運體的表達，導致腫瘤細胞對化療不敏感。SMC4是PGAM1轉錄的協同激活劑，而SMC4和PGAM1的協同缺失會影響F-actin組裝，導致有絲分裂失敗和多倍體形成，從而抑制細胞增殖。這些對非遺傳化療耐藥機制的洞察可能對該領域具有重要意義，增進我們對腫瘤中需氧糖酵解功能的理解，并可能為未來的治療策略提供參考。

原文鏈接
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(23)00264-4