為保護人們免受流感病毒感染，并減少與流感有關的死亡人數，生物制品公司每年都需要生產流感疫苗。因此，相關企業(yè)能 及時生產和驗證各批次流感疫苗是至關重要的。每批疫苗都需根據其中血凝素(HA)含量評估效力。流感病毒可利用血凝素(HA)，與宿主細胞膜上的唾液酸受體結合，侵染細胞。^[1]

目前評估疫苗批次的金標準方法是單徑向免疫擴散(SRID)試驗，它讓病毒抗原在含有抗原特異性抗體的瓊脂糖凝膠中擴散。然后，測量沉淀帶的大小，使用一組校準過的參考抗原將沉淀帶的大小與樣品中抗原的數量相關聯^[2]。盡管SRID自1978年以來一直在使用，但它有一些缺點。首先，它是一種離線方法，因為樣品必須從生產線上取出，通過一個單獨的過程進行分析。其次，SRID所需的參比血清和抗原試劑可能需要6個月的準備時間，從而導致疫苗批次上市的延遲^[3]。此外，SRID的分析精度和通量也較低^[4]，執(zhí)行SRID大約需要22小時^[5]。因此，迫切需要開發(fā)一種更快速的方法來評估流感和其他疫苗的效力，特別是在流感疫情爆發(fā)時期。

雖然有其他基于免疫測定法和色譜法的方法可以確定疫苗制劑中的HA含量，但它們缺乏對生產中病毒顆粒進行過程分析的能力。免疫測定也被認為是費時費力的。而表面等離子體共振(SPR)檢測可以在幾分鐘到幾小時內產生實時數據，并且樣本無需標記。通過表面化學優(yōu)化和生物分子選擇性捕獲，可以實現對目標生物分子的高靈敏度和高重復性的檢測。Affinite儀器公司緊湊型的SPR儀器將使基于細胞的病毒顆粒生產的在線實時監(jiān)測成為現實。

本應用案例將展示利用Affinite的P4SPR^TM對流感疫苗生產中HA含量進行監(jiān)測的潛在用途。

實驗過程
系統(tǒng)設置和傳感器芯片功能化
本研究使用了配備4個獨立微流控通道的P4SPR™(圖1)。
 

圖1     4通道分子互作儀P4SPR^TM

首先，使用去離子水通過SPR裝置運行60s，以確保基線的穩(wěn)定性。然后，為了減少非特異性結合，使用我們專有的Afficoat^TM表面修飾的金膜傳感器芯片，并將所有以下蛋白質樣品和試劑手動注射到P4SPR中(見圖1)。為了激活傳感器表面以捕獲抗體固定，用EDC/NHS處理；隨后用乙酸鈉洗滌。將HA捕獲抗體(10µg/mL)固定于傳感芯片表面，反應20分鐘；隨后用乙酸鈉進行清洗。為了減少非特異性結合，通過注射1 M乙醇胺(pH 8.5)阻斷傳感器表面的活性位點，反應10分鐘。然后用運行緩沖液沖洗傳感器表面。圖2描述了在金膜傳感器芯片上的實驗設置。
 

圖2    SPR法檢測血凝素的實驗示意圖

HA標準曲線
利用運行緩沖液制備HA，在A至C通道中從0.5µg/mL滴定至25µg/mL，每次10分鐘。圖3顯示了放置在傳感器芯片頂部的微流控通道圖案。作為對照，通道D用于注入運行緩沖液。每組HA濃度和運行緩沖液的SPR信號位移保存在P4SPR控制軟件中。
 

圖3    四通道分子互作儀P4SPR^TM的微流控通道俯視圖

結果與討論
初始的P4SPR^TM洗滌、穩(wěn)定和傳感器芯片功能化步驟大約需要38分鐘。注入HA樣品以創(chuàng)建標準曲線大約需要1小時。因此，生成標準曲線所需的總時間約為1小時40分鐘。

依次注射HA濃度時，共振信號成比例增加，證明了HA與固定的抗HA抗體的結合(圖4)。在每個HA濃度下，將三個重復的共振信號平均并在Excel中繪制。得到的標準曲線R2為0.98，表明濃度在0.5-25µg/mL之間具有高度的線性關系(圖5)。
 

圖4    各濃度HA在通道A, B和C(紅色、白色、綠色 三次重復)以及參照通道D(藍色)的傳感信號
 

圖5.  血凝素與抗血凝素抗體結合標準曲線

結論
本研究表明，P4SPR^TM可以固定抗HA抗體到我們專有的Afficoat^TM傳感器芯片上，并有潛力通過建立標準曲線來檢測樣品中的HA濃度。傳感器表面準備可在40分鐘內完成，每個樣品只需要10分鐘即可獲得數據。通過進一步的實驗優(yōu)化，P4SPR將能夠在實際生產和純化疫苗樣品中評估病毒效力。

Affinite儀器優(yōu)勢～
Affinite儀器公司的P4SPR^TM四通道設計，無論作多樣本篩選，還是重復性檢測，都能輕松實現。高效便捷和信號穩(wěn)定是P4SPR的主要特點；也是百萬以內少有的四通道分子互作儀。在疫苗生產過程中，安裝在線SPR儀器對疫苗批次進行實時評價是有利的。同時，在生物醫(yī)藥研究的其他領域，P4SPR也能幫助用戶揭示生物分子相互作用的奧秘。

參考文獻
1. Emi Suenaga, Hiroshi Mizuno & Penmetcha K.R. Kumar. Influenza virus surveillance using surface plasmon resonance. Virulence, 2012, 3, 464-470.

2. M.S.      Williams.      Single-radial- immunodiffusion as an in vitro potency assay for human inactivated viral vaccines. Vet. Microbiol., 1993, 37, 253-262.

3. Laurent Durous, Thomas Julien, Blandine Padey, Aurélien Traversier, Manuel Rosa- Calatrava, Loïc J. Blum, Christophe A. Marquette, Emma Petiot. SPRi-based hemagglutinin quantitative assay for influenza vaccine production monitoring. Vaccine, 2019, 37, 1614-1621.

4. Carl-Fredrik Mandenius, Ronghui Wang, Anna Alden Gunnar Bergstrom, Sabine Thebault, Charles Lutsch, Sten Ohlson. Monitoring of influenza virus hemagglutinin in process samples using weak affinity ligands and surface plasmon resonance. Anal. Chim. Acta, 2008, 623, 66- 75.

5.C. Estmer Nilsson, S. Abbas, M. Bennemo, A. Larsson, M.D. Hämäläinen, Å. Frostell- Karlsson. A novel assay for influenza virus quantification using surface plasmon resonance. Vaccine, 2010, 28, 759–766.