一提到安定或地西泮，人們就會想到抗抑郁藥和抗焦慮藥。如果您有藥理學背景，您可能還會想到苯二氮卓（BDZs）這類古老的藥物。但氧化應激和腎上腺素能受體的調節又是怎么回事呢？羅馬國立衛生研究院的一項新研究對地西泮等β-AR激動劑治療期間β1-和β2-腎上腺素能受體（β1- AR和β2-AR）的調節提供了一些令人著迷的見解1。
 

在這項研究過程中，研究人員使用了針對 β-ARs 細胞外表位的特異性抗體和流式細胞術來評估單核細胞中這些受體的細胞表面調控。他們發現地西泮會刺激氧化應激的調節劑，進而影響細胞表面的 β1-AR 密度。此外，他們還發現這些受體不易受激動劑介導的下調影響。

什么是β-腎上腺素能受體？

β-腎上腺素能受體屬于 G 蛋白偶聯受體（GPCR）超家族，通過激活腺苷酸環化酶對兒茶酚胺做出反應。GPCR 具有復雜的信號調節機制，如下調細胞表面受體密度2。
 

β-ARs亞型β1-、β2-和β3-ARs在組織分布、脫敏機制和激活特定信號通路方面各不相同，在控制心臟功能和調節免疫活動方面發揮著不同的作用。因此，人們非常希望了解調節 β-AR 表達的機制，以便針對與 β-AR 失調相關的疾病開發出更有效的療法。因此，在開發治療因 β-AR 失調引起的疾病的方法時，β-AR 表達是研究的首要候選對象。
 

雖然人們對激動劑介導的人類β2-腎上腺素能受體下調了解很多，但對人類 β1-AR下調的了解卻較少。有趣的是，一些研究表明，氧化應激在調節 β-AR 的表達中發揮作用3，包括選擇性地降低小鼠心肌細胞中 β1 腎上腺素能受體的表達。
 

外周苯并二氮雜卓受體（PBR）又名線粒體轉運蛋白（TSPO），在調節氧化應激、線粒體生理機能和細胞能量方面起著至關重要的作用。它還能使壓力過大的心肌細胞的細胞能量和氧化還原平衡正常化。因此，研究人員假設 PBR 信號傳導可能參與了細胞表面 β-AR 密度的調節。
 

為了驗證這一點，他們研究了不同的PBR配體如何影響單核細胞中β1和β2-AR的表面密度。

合適的研究試劑

抗體特異性顯然是所有研究人員都非常關注的問題。但當涉及到 GPCR 等具有挑戰性的靶標時，對抗體的信心至關重要。本研究的研究人員使用了Alomone的抗體來檢測細胞表面β1-和β2-腎上腺素能受體的表達。
 

研究小組在流式細胞術和免疫熒光測定中使用了FITC 直標抗體： Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-023-F)和Anti-β2-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-016-F)。由于這些抗體靶向細胞外表位，設計用于識別小鼠、大鼠和人類樣本中的β1和β2腎上腺素能受體，因此他們在表達β1和β2腎上腺素能受體亞型的細胞（如人類THP-1細胞）以及缺乏β1-AR、β2-AR或兩種AR的基因敲除（KO）小鼠單核細胞中進行了測試。
 

用抗β1-和抗β2-腎上腺素能受體抗體進行免疫測定

(左圖）使用 Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular) Antibody (#AAR-023)（1:400）對大鼠背側劍突核和小鼠小腦進行免疫組化染色。A. β1-腎上腺素受體染色（紅色）出現在大鼠背側劍突核的神經元中（水平箭頭）。C. 在小鼠小腦的顆粒細胞（水平箭頭）和浦肯野細胞層（垂直箭頭）中檢測到 β1-腎上腺素受體染色（紅色）。B、D. 用 DAPI 作為反染色劑進行核染色（藍色）。(右圖）使用抗β2-腎上腺素能受體（細胞外）抗體（#AAR-016）（1:100）對大鼠肺部石蠟包埋切片進行免疫組化染色。β2-腎上腺素受體在呼吸道上皮細胞中表達。血色素用作反染色。

流式細胞儀顯示，抗體清楚地標記了細胞表面內源性表達 β-AR 的 THP-1 細胞中的受體。

現在很清楚，Alomone的β-AR抗體能結合β-AR，但它們能區分β1和β2-AR嗎？研究小組利用分離自小鼠的外周血單核細胞顯示，野生型小鼠細胞中β1-和β2-AR表達的MFI值明顯高于KO型小鼠細胞。Alomone 的 β-AR 抗體成功結合了 β-AR 并區分了 β1- 和 β2-AR 亞型。抗體驗證完成后，研究的三個主要問題就開始了：β1-AR 和 β2-AR 是否受 β-AR 激動劑的不同調節？氧化應激和 PBR/TSPO 配體對 β-AR 表面密度有影響嗎？造成 β-AR 表達變化的機制是什么？

β1-和β2-腎上腺素能受體是否受到不同的調控？

以前的研究表明，與β2-AR相比，β1-AR對激動劑的下調具有抵抗力4。為了驗證這一點，研究人員用腎上腺素或異丙腎上腺素（一種外源性兒茶酚胺）刺激單核細胞長達 48 小時。流式細胞術和Alomone針對β-ARs的選擇性抗體顯示，內源性β2-腎上腺素能受體的細胞表面密度降低了，而β1-ARs則不受影響。這種對β-ARs的不同調控可能對開發針對不同組織中β腎上腺素能受體的治療藥物具有重要意義。

氧化應激會影響β1-和β2-腎上腺素能受體的密度嗎？

之前的研究表明，通過急性過氧化氫或慢性多柔比星治療誘導的氧化應激會降低心肌細胞中β1-AR的表達5，基于這一研究，研究小組想看看氧化應激是否也會影響β1-腎上腺素能受體的密度。
 

研究人員用地西泮（PBR/TSPO 的配體）處理單核細胞，發現它導致了 β1-AR 密度的降低，但 β2-AR 的豐度沒有變化。與β-受體阻滯劑普萘洛爾不同，PBR/TSPO拮抗劑PK1119能夠逆轉地西泮的作用，這表明PBR/TSPO參與了β1-ARs細胞表面密度的調節。
 

這一發現表明，對β-ARs的影響實際上并非由氧化應激介導，因為在地西泮處理后沒有觀察到氧和氮自由基的產生發生變化。

β1-腎上腺素能受體密度變化背后的機制是什么？

到目前為止，我們已經看到，β1-和β2-AR 在單核細胞中確實受到不同程度的調節，β1-AR 對激動劑介導的下調具有更強的抵抗力。相反，暴露于地西泮后，β1-AR 密度降低，我們發現 PBR 拮抗劑 PK11195 可拮抗這種效應。為了推斷這些結果的機制，研究人員研究了地西泮如何影響轉錄和受體合成，以及單核細胞對 GRK-2 的表達，GRK-2 是一種參與 β 腎上腺素能受體脫敏和內化的激酶6。他們還研究了地西泮對β1和β2腎上腺素能受體與Gα蛋白亞基或β-arrestin-2相互作用的影響。
 

有趣的是，他們發現地西泮對β1-AR或GRK-2的mRNA或蛋白水平均無影響，也不影響β-AR亞型與Gα蛋白或β-arrestin-2的相互作用。然而，PBR/TSPO在調節β1-AR表面密度方面的作用似乎很明顯。因此，研究人員推測地西泮可能會通過改變其向質膜的再循環來影響β1-AR的表面密度。

對心血管的影響

這項研究為了解β-AR行為和相互作用的復雜調控機制提供了重要見解。考慮到β-AR在心血管治療中的重要性（例如以β-受體阻滯劑的形式），這些研究結果表明，靶向PBR/TSPO可能是調節β1-AR表達的一種有前途的策略。
 

這項研究還強調了驗證抗體的重要性，即使是高度特異性的抗體也需要驗證！Alomone 的抗體能讓您靈活地使用多種免疫測定來揭示最復雜的機制。

References

1.Matarrese P, Maccari S, Gambardella L, Vona R, Barbagallo F, Vezzi V, Stati T, Grò MC, Giovannetti A, Catalano L, Molinari P, Marano G, Ambrosio C. Benzodiazepine diazepam regulates cell surface β1-adrenergic receptor density in human monocytes. Eur J Pharmacol. 2023 Jun 5;948:175700. doi: 10.1016/j.ejphar.2023.175700. Epub 2023 Mar 29. PMID: 37001579.

2.Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, Caron MG. Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev Neurosci. 2004;27:107-44. doi: 10.1146/annurev.neuro.27.070203.144206. PMID: 15217328.

3.Zhu J, Steinberg SF. β1-adrenergic receptor N-terminal cleavage by ADAM17; the mechanism for redox-dependent downregulation of cardiomyocyte β1-adrenergic receptors. J Mol Cell Cardiol. 2021 May;154:70-79. doi: 10.1016/j.yjmcc.2021.01.012. Epub 2021 Feb 6. PMID: 33556394; PMCID: PMC8068644.

4.Liang W, Austin S, Hoang Q, Fishman PH. Resistance of the human beta 1-adrenergic receptor to agonist-mediated down-regulation. Role of the C terminus in determining beta-subtype degradation. J Biol Chem. 2003 Oct 10;278(41):39773-81. doi: 10.1074/jbc.M304482200. Epub 2003 Jul 29. PMID: 12888573.

5.Park M, Steinberg SF. Carvedilol Prevents Redox Inactivation of Cardiomyocyte Β1-Adrenergic Receptors. JACC Basic Transl Sci. 2018 Aug 28;3(4):521-532. doi: 10.1016/j.jacbts.2018.06.002. PMID: 30175276; PMCID: PMC6116783.

6.Iaccarino G, Ciccarelli M, Sorriento D, Galasso G, Campanile A, Santulli G, Cipolletta E, Cerullo V, Cimini V, Altobelli GG, Piscione F, Priante O, Pastore L, Chiariello M, Salvatore F, Koch WJ, Trimarco B. Ischemic neoangiogenesis enhanced by beta2-adrenergic receptor overexpression: a novel role for the endothelial adrenergic system. Circ Res. 2005 Nov 25;97(11):1182-9. doi: 10.1161/01.RES.0000191541.06788.bb. Epub 2005 Oct 20. PMID: 16239589.