本文要點：高質量的近紅外二區（NIR-II）納米探針可用于檢測疾病、監測治療過程和了解疾病發展，對實時生物成像和醫學診斷具有重要意義。菁是構建可激活探針的一類重要熒光團，基于菁的NIR-II熒光團往往具有優異的光學性能、簡單的合成方法和極高的吸收，然而其生物學應用卻受到包括水溶液中呈弱熒光、穩定性差和特異性不足等缺點的阻礙。

本文采用分子工程開發了具有明亮、穩定發射和高特異性的基于菁的可激活NIR-II納米平臺。采用聚（苯乙烯-馬來酸酐）（PSMA）封裝NIR-II熒光分子IR1048，以獲得穩定明亮的NIR-II納米顆粒（PSMA@IR1048 NP）。通過電荷調制策略，將一系列菁熒光團負載在PSMA@IR1048 NP上，對活性物質表現出可調響應。結合兩種策略，構建了NIR-II比率型熒光納米探針RNP，包括RNP1、RNP2和RNP3；其中，RNP2表現出次氯酸（HClO）響應性能，并產生更高的NIR-II熒光比（FL2/FL1）信號。這種納米探針能夠可靠地報告糖尿病肝損傷和下肢缺血再灌注（I/R）損傷小鼠模型中的病理性HClO水平。為構建用于生物成像的穩定、明亮和特異的基于菁的NIR-II探針提供了策略。

 

 

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作者首先將IR780和IR1048作為納米顆粒核心的備選分子，選用了一系列兩親性多聚物來封裝IR780（圖1a）和IR1048（圖1e），以改善它們在H2O中的光學性質和對HClO的化學穩定性。其中，PSMA@IR780 NP在加入HClO后780nm處的吸光度沒有顯著變化，顯示出較好的穩定性（圖1b, c），這可能歸因于其相對較低的ζ電位（圖1d），導致納米顆粒和HClO間產生強烈的靜電排斥。在多聚物結合IR1048所得的納米顆粒中，DSPE-PEG@IR1048 NP和PSMA@IR1048 NP的吸收光譜具有1048nm的特征峰，證實IR1048可以成功地結合到DSPE-PEG和PSMA中，而其余納米顆粒在1048nm處的吸光度可忽略不計（圖1f）。調整IR1048 NP中PSMA和DSPE-PEG的比例，發現隨著PSMA的百分比從0%增加到100%，在H2O中其NIR-II熒光強度逐漸增加（圖1g），對HClO的穩定性也不斷增加（圖1h），ζ電位逐漸降低（圖1i）。這表明PSMA可以提高IR1048在水溶液中的熒光強度和化學穩定性。因此，選擇PSMA@IR1048NP進行表征和后續成像實驗。

PSMA@IR1048 NP可以很好地分散在水中，在透射電子顯微鏡下呈直徑約30nm的球形（圖1j）。在水中顯示出明亮穩定的NIR-II熒光，強度高于H2O或MeOH中的游離IR1048染料（圖1k）。在與不同活性物質孵育后，其吸光度和熒光沒有明顯變化，表現出良好的穩定性（圖1l, m）。

圖1.（a）兩親性聚合物和IR780的化學結構。兩親性聚合物@IR780 NPs的一步自組裝。游離染料IR780和用不同兩親性聚合物修飾的IR780在與HClO孵育之前（b）和之后（c）的吸收光譜。（d）用不同兩親性聚合物修飾的IR780的ζ電位。（e）兩親性聚合物@IR1048 NPs的一步自組裝。（f）不同兩親性聚合物修飾的IR1048的吸收光譜。（g）不同PSMA和DSPE-PEG比例的兩親性聚合物@IR1048 NPs的熒光強度。插圖：納米顆粒相應的熒光圖像。（h）不同PSMA和DSPE-PEG比例的兩親性聚合物@IR1048 NPs在與HClO孵育前后的1048nm處的吸光度。（i）用不同比例的PSMA和DSPE-PEG修飾的IR1048的ζ電位。（j）PSMA@IR1048 NPs在H2O中的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。（k）IR1048在H2O、MeOH中和PSMA@IR1048 NPs在H2O中的NIR-II（1100-1700 nm）熒光對比。PSMA@IR1048 NPs在PBS中與各種活性物質孵育后的的吸收（l）和熒光（m）光譜。1：PBS；2：1O2（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H2O2（50μmol/L）；6：·O2−（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO−（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激發波長：980nm。

 

接下來，將一系列菁基熒光團負載在PSMA@IR1048 NP上，構建比率型NIR-II探針RNP（圖2a, e, i）。相較于游離菁基染料，RNP由于其在水溶液中的溶解度得到改善，表現出更明顯的氰基熒光團特征吸收峰（780nm）和強熒光發射（820nm）（圖2b, f, j）。RNP的化學穩定性與所負載的菁基染料的電荷有關。攜帶+1凈電荷的IR780分子靜電吸附增強，從而顯著提高其化學穩定性，加入活性物質后吸光度和熒光幾乎恒定。而IR775S和IR796帶有0和−1的凈電荷，靜電吸附減弱，使它們更容易被活性物質破壞（圖2c, g, k）。值得注意的是，RNP2在加入HClO后吸光度急劇下降，而對其他活性物質有較好的穩定性，這成為構建比率型熒光納米探針的基礎。此外，RNP的光穩定性也得到改善（圖2d、h、l）。

圖2. NIR-II比率熒光納米探針RNP1（a）、RNP2（e）、RNP3（i）的構建。（b）IR780和RNP1在H2O中的熒光光譜。（f）IR775S和RNP2在H2O中的熒光光譜。（j）IR796和RNP3在H2O中的熒光光譜。RNP1（c）、RNP2（g）、RNP3（k）與各種活性物質孵育后的吸收光譜。RNP1（d）、RNP2（h）、RNP3（l）在808nm激光（180s，200mW/cm2）下的吸收光譜。

 

如圖3a，RNP2表面的IR775S在HClO存在時顯示出“關閉”NIR-II熒光（FL1，激發波長808nm），同時核心中的IR1048對HClO足夠穩定，因此提供了穩定的NIR-II輸出信號（FL2，激發波長980nm）。RNP2在水溶液中分散性良好，呈球形（~30nm）（圖3b）。

接著調節HClO濃度驗證RNP2對HClO的響應特性。檢測吸收光譜發現，隨HClO濃度從0增加到20μmol/L，RNP2在約780nm處的吸光度逐漸降低，而IR1048特征吸收峰的變化可忽略（圖3c）。熒光光譜也顯示，IR775S的特征峰（~820nm）隨HClO的濃度增加不斷降低，而IR1048峰無顯著變化（圖3e, f）。將FL2熒光圖像除以FL1圖像來進一步構造比率圖像（FL2/FL1），發現RNP2的FL2/FL1比率隨HClO濃度的升高而逐漸增加（圖3d, g）。相較于其他活性物質，在HClO存在時的FL2/FL1比例提高了約30倍，表明RNP2對HClO具有優異的特異性（圖3h, i）。

圖3.（a）用于HClO比率熒光成像的RNP2方案。（b）RNP2的代表性TEM圖像。（c）RNP2與0–20μmol/L HClO孵育后的吸收光譜。（d）在與不同濃度的HClO孵育后，RNP2的FL1（激發波長：808nm，發射波長：1100-1700nm）、FL2（激發波長：980nm，發射波長：1100-1700nm）和FL2/FL1的熒光圖像。（e）RNP2與不同濃度的HClO孵育后的熒光光譜。激發波長：740和980nm。（f）RNP2在820nm處的熒光與（e）中的HClO濃度之間的線性關系。（g）在用（e）中不同濃度的HClO孵育后RNP2的FL2/FL1的定量。（h）選擇性反應：與不同活性物質孵育后，RNP2的FL1、FL2和FL2/FL1的熒光圖像。1：PBS；2：1O2（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H2O2（50μmol/L）；6：·O2−（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO−（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激發波長：808和980 nm，發射：1100–1700 nm。（i）與不同活性物質孵育后RNP2的歸一化FL2/FL1比率。

 

糖尿病是一種以血糖水平升高為特征的代謝紊亂。在高血糖狀態下，肝臟葡萄糖異常升高，其氧化磷酸化會導致ROS過度產生，而ROS在糖尿病的進展和發展中起到重要的作用。因此，實時檢測HClO水平對于糖尿病的輔助診斷非常重要。受RNP2對HClO具有良好選擇性的啟發，作者進一步使用RNP2對糖尿病小鼠的HClO水平進行實時成像。

注射生理鹽水的小鼠為健康小鼠（第1組）；腹膜內注射鏈脲佐菌素以獲得糖尿病小鼠（2-4組）；用二甲雙胍治療糖尿病小鼠，以緩解糖尿病期間的氧化應激（第5組）。（圖4a）。可見第2-4組的小鼠體重逐漸下降（圖4b），其中第4組的血糖水平顯著升高（圖4c）。熒光成像結果顯示，第1、5組顯示出強烈的FL1熒光，而第2-4組FL1的熒光強度逐漸降低（圖4d, e）。且從第1組到第4組，FL2/FL1的比率顯著增加（圖4f），表明隨著糖尿病的持續進展，HClO水平升高。結合檢測時間可知，基于RNP2的比率熒光成像能夠比體重變化早至少1天檢測出鏈脲佐菌素誘導的糖尿病，比血糖測定早至少6天檢測出糖尿病。

作者還研究了糖尿病與肝損傷之間的關系，發現糖尿病過程導致血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）顯著增強（圖4g, h）。肝臟組織學分析結果也顯示，與健康小鼠和治療組相比，在不同進展的糖尿病小鼠中觀察到炎性細胞浸潤和空泡變性，并且晚期糖尿病小鼠的損傷比早期糖尿病小鼠更嚴重（圖4i），證明肝損傷與糖尿病之間存在積極關系。

圖4.（a）RNP2用于糖尿病小鼠成像和給藥程序的方案。（b）糖尿病小鼠在不同時間點的相對體重。（c）1-4組小鼠的血糖濃度（ns：無顯著差異，****：P<0.0001，ANOVA）。當平均血糖濃度被確定為大于11.1mmol/L時，認為小鼠中已經發生糖尿病。（d）靜脈注射RNP2 10分鐘后，1-5組小鼠的FL1、FL2和比率FL2/FL1圖像。FL1激發波長：808 nm，FL2激發波長：980 nm。發射波長：1100-1700 nm。黃色曲線表示肝臟區域。（e, f）靜脈注射RNP2 10分鐘后，第1-5組小鼠的歸一化FL1、FL2和FL2/FL1比率的量化。（g, h）1-5組小鼠的ALT和AST濃度。（i）1-5組小鼠肝臟的代表性H&E染色切片。

 

下肢I/R損傷是骨科手術中常見的主要并發癥，通常伴有過表達的ROS水平。及時測量升高的ROS水平對檢測I/R損傷程度具有重要意義。因此將RNP2用于對I/R損傷模型中的實時HClO水平進行成像。

小鼠右大腿接受短缺血（30分鐘）或長缺血（60分鐘），假手術組（左大腿）作為對照組，然后均再灌注90分鐘，并腹腔注射RNP2，然后進行NIR-II成像（圖5a）。在注射RNP2后0、60和90分鐘，假手術組的下肢區域顯示出FL1和FL2強熒光，而缺血組顯示出弱FL1熒光（圖5b-d）。其中，長缺血組由于HClO量較高且損傷嚴重，比短缺血組表現出更低的FL1強度和更高的FL2/FL1比率。

此外，對這些小鼠的下肢切片進行了組織學分析（圖5e）。與假手術組相比，在I/R損傷區域可觀察到炎癥細胞浸潤，并且長缺血小鼠（60分鐘）的損傷比短缺血小鼠（30分鐘）的更嚴重，表明I/R過程對小鼠的嚴重損傷。

圖5.（a）下肢I/R過程的代表性程序。（b）靜脈注射RNP2 0、60和90分鐘后短缺血和長缺血小鼠的FL1、FL2和比率FL2/FL1圖像。發射波長：1100-1700 nm。黃色曲線表示假手術區域和I/R區域。（c, d）在注射RNP2 0、60和90分鐘后，短時間和長時間缺血小鼠的標準化FL2/FL1比率的量化（平均值±s.d.，*：P<0.05，ANOVA）。（e）短時間和長時間缺血小鼠肌肉的代表性H&E染色切片。

 

總之，本研究開發了一種簡易的分子工程策略來構建基于菁的NIR-II比率成像納米平臺，并且成功開發了一種電荷調制策略，以調節納米顆粒對活性物質的反應性，賦予其特定的HClO響應性能。所制備的RNP2可以避免疾病部位其他活性物質的干擾，從而可靠地檢測HClO的病理水平，顯示了基于菁基的納米探針在特定疾病的NIR-II熒光成像中的良好潛力，該策略可能為設計其他明亮穩定的NIR-II納米探針及其生物應用提供見解。

 

參考文獻

Ma, Y.; Liu, L.; Ye, Z.; Xu, L.; Li, Y.; Liu, S.; Song, G.; Zhang, X.-B., Engineering of cyanine-based nanoplatform with tunable response toward reactive species for ratiometric NIR-II fluorescent imaging in mice. Science Bulletin 2023.

 

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