空間轉錄組測序

常見Q&A合集

Part.01 樣品

Q1：空間轉錄組適用的樣品類型？

新鮮樣本可以適用于多個物種，包括：人類、小鼠、大鼠、斑馬魚；FFPE樣本僅適用于人類和小鼠。

目前10x Genomics官方推薦的樣本物種包括：

新鮮樣本包括：人類（大腦、脊髓、心臟、乳房、乳腺、肺、淋巴結、腎臟、大腸-結直腸癌、卵巢、脾臟等）、鼠（大腦、眼睛、心臟、脊髓、股四頭肌、眼睛、肺、甲狀腺、肝臟、脾臟、胃、腎臟、大腸、小腸、睪丸、卵巢、嗅球、肱四頭肌、舌頭等）；  

FFPE樣本包括：人類（大腦、胸部、宮頸、心臟、脊柱、脊髓、肺、淋巴結、脾、前列腺、皮膚、腸、子宮等），小鼠（大腦、心臟、肝、脾、腎、睪丸、胸腺、胚胎、肌肉、子宮、胎盤、小腸、舌頭以及皮膚等）。

若樣本不在測試行列內，則需要進行評估。

對于FFPE樣本，常規Visium只接收石蠟塊組織樣本；新推出的CytAssist產品可以兼容石蠟塊、白片、預貼片或預染色的石蠟切片（10x標準中推薦的載玻片貼片）以及組織芯片（TMA）等多種樣本類型。

Q2：確定做空間轉錄組的樣本應該怎么處理？

（1）對于新鮮組織，處理和保存方法如下：

先冷凍后包埋法：新鮮組織樣本取下后要迅速用預冷的鑷子將新鮮組織浸沒在異戊烷至組織完全冷凍，然后進行OCT包埋（盡量保持15min內）。若無異戊烷，也可直接進行OCT包埋。公司官網（https://www.shbiochip.com/）提供詳細的OCT包埋教學視頻，同時也提供不同型號的包埋盒，可根據需要進行選擇。

🔸 樣本能否直接液氮凍存？

不可以液氮直接速凍，直接液氮處理可能在沸騰過程中使組織周圍形成空穴，導致不同區域降溫不同步而改變內部形態，甚至組織碎裂。

🔸 若組織表面有血跡能否進行沖洗？

用預冷的PBS溶液或生理鹽水進行沖洗，但沖洗后需要用干凈的吸水紙吸干液體，防止形成冰晶，影響包埋。

（2）對于FFPE樣本，處理及運輸要求如下：

🔸 常規Visium ：

4℃密封保存運輸石蠟塊樣本（建議用包埋盒送樣，防止運輸過程中樣本損壞）。

🔸 CytAssist：

CytAssist不同類型FFPE樣本送樣要求

10x Genomics官方推薦的品牌玻片有效區域示意圖

🔸 若石蠟切片單個樣本切少于或超過5μm厚度，還能做空間轉錄組實驗嗎？

5μm是10x官方測試時采用并推薦的厚度，若實際組織超過或小于5μm，評估合格后也可做空間轉錄組，但可能會影響最終數據結果。

🔸 FFPE樣本想要做空間轉錄組測序，最多保存多久？

推薦是保存在一年之內的樣本，若超過一年，可以先取少量樣本進行質量評估，若質檢合格，也可進行空間轉錄組實驗。因組織類型、時間和存放條件的不同，RNA的降解速度也會存在差異，因此僅依靠存放年限無法準確判斷石蠟包埋塊是否可用。目前是主要根據包埋塊切片RNA的 DV200>50%（最新CytAssist要求DV200>30%）指標來確定（不論樣本保存時間是否超過一年，都需要先進行質檢）。

🔸 樣本規格要求，是否超過6.5*6.5mm即無法做空間轉錄組？

根據芯片規格推薦樣本大小在6.5*6.5mm之內，但是如果組織樣本過大，對于新鮮樣本現階段可以提供兩種解決方案：1）選取整個組織中感興趣的區域（小于6.5*6.5mm），實驗人員評估修片可行性，然后決定是否進行后續實驗；2）若整個組織都為目標區域，則將組織分為兩份，分別貼片到兩個點陣進行后續實驗。

常規Visium芯片規格

此外，10x 公司新推出的CytAssist，提供了兩種芯片規格可供選擇，分別為6.5*6.5mm和11*11mm，較大組織也可實現一次性檢測，現在已經可用于FFPE樣本實驗，并且后續升級后也可應用于新鮮樣本。

CytAssist芯片規格

新鮮/FFPE樣本質檢要求

Part.02 常規Visium 與CytAssist相比做了哪些更新？

Q1: 實驗流程

🔸 常規Visium實驗流程：

樣本貼片于Visium芯片 ➡  脫蠟、HE染色、成像➡  探針雜交 ➡  建庫和測序

🔸 CytAssist實驗流程：

FFPE組織切片后貼于標準載玻片  ➡  脫蠟、染色、成像、解交聯、探針雜交 ➡  CytAssist儀器中完成分析物轉移 ➡  建庫和測序

🔸 流程更新：

常規Visium的脫蠟、HE染色、成像以及探針雜交等步驟在Visium空間芯片上進行；CytAssist的脫蠟、染色、成像、解交聯和探針雜交等步驟在標準載玻片進行，隨后在Visium CytAssist儀器中進行明場成像以及完成分析物轉移，無需進行多次切片貼片及粘附性測試實驗，極大的簡化了樣本的處理。

常規Visium vs CytAssist實驗流程對比

Q2: 其他

常規Visium vs CytAssist

Part.03 單細胞+空間聯合分析

Q1: 空間轉錄組是單細胞分辨率的嗎？

空間轉錄組的檢測不是單細胞層面的，Visium芯片一個玻片上每個捕獲區域面積為6.5mm*6.5mm（CytAssist提供了6.5mm*6.5mm和11mm*11mm兩個規格芯片），每個點陣內有約5000個spot，根據樣本類型不同，每個spot內的細胞數約1-10個細胞。Q2: 為什么要做空間轉錄組？

組織中除了細胞異質性，其空間分布對于疾病的發生發展也有重要的意義。單細胞測序能夠鑒定組織中的細胞類型，但有時會發現對照組和處理組的細胞類型相似。以腫瘤為例，通過單細胞測序，可能在對照組和處理組都發現了相同的免疫細胞類型，而免疫細胞浸潤對疾病的發展和預后具有明顯的影響。因此，如果僅僅靠單細胞一個層面的數據，有時是很難解釋清楚，此時細胞類型在組織的空間分布對于數據分析就顯得尤為重要。通過結合空間轉錄組能夠將不同細胞類型表達的marker基因映射到空間上，從而比較不同組織類型間細胞類型的空間分布特征。單細胞聯合空間轉錄組分析不僅可以提高細胞類型注釋的可靠性，還可以精確全面地揭示表達譜信息，特定細胞類型及其特定空間位置、特定生物學過程中的信號傳導過程、細胞和細胞之間的通訊聯系（在空間上是否真實分布在臨近區域）。

此外，傳統的FISH和IF雖然可以觀察到病理組織的空間信息，但屬于中低通量的檢測，多用于篩選后的結果驗證。

Q3: 如何跟單細胞聯合分析？

（1）通過單細胞細胞類型鑒定結果輔助判定細胞的空間分布

通過分析單細胞數據，確定于疾病密切相關的細胞群，然后通過將單細胞注釋到的細胞群marker基因圖譜與空間數據進行關聯分析，確定不同細胞類型的空間分布，為了解細胞類型的特定空間位置分布提供依據。

（2）對比不同分組間的空間結果，深入挖掘單細胞數據

🔸 分析不同細胞類型如何分布（在疾病區域、鄰區或正常區域），確定空間結構是否具有明確區域劃分；

🔸 通過分析轉錄組數據，不同區域之間是否有特異性的差異基因；

🔸 不同區域的細胞之間是否存在細胞互作關系，并聯合特異性的差異基因功能分析，探討細胞互作涉及的分子機制及通路，尋找疾病發病機制及治療靶點。

Q4: 空間轉錄組測序和單細胞轉錄組測序一起進行聯合分析，是否每個空轉的樣本都需要搭配相同樣本的單細胞轉錄組？

如果空轉的樣本來自不同的患者，推薦每個患者各做一個單細胞測序。如果有幾個空轉的樣本來自一個患者的同一個組織，可以這幾個樣本做一個單細胞，具體還需要根據不同的實驗設計決定樣本量，但是有一個基本前提：單細胞和空間樣本在病理上出現的細胞類型是重合的。