雜交瘤基因測(cè)序流程介紹
1.什么是雜交瘤測(cè)序
雜交瘤細(xì)胞抗體基因測(cè)序是指使用專業(yè)的兼并引物設(shè)計(jì)（degenerate primer）和測(cè)序方案，同時(shí)優(yōu)化經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間成本，為客戶提供快速準(zhǔn)確的抗體可變區(qū)域以及全長(zhǎng)基因測(cè)序服務(wù)。
圖1：雜交瘤測(cè)序
2.雜交瘤測(cè)序目的
雜交瘤細(xì)胞在保存過(guò)程中存在抗體基因丟失、細(xì)胞狀態(tài)不好影響抗體產(chǎn)生，甚至細(xì)胞死亡的情況，為將優(yōu)秀抗體長(zhǎng)期保存、穩(wěn)定生產(chǎn)，可將雜交瘤細(xì)胞中的抗體基因提取并測(cè)序，最終拿到核苷酸序列，并以 DNA 形式保存，用于后期外源表達(dá)及生產(chǎn)。3.雜交瘤測(cè)序應(yīng)用
雜交瘤細(xì)胞抗體測(cè)序所獲取的雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體基因序列，是發(fā)表文章或?qū)＠仨毿畔⒑椭亟M表達(dá)工程抗體的前提之一，同時(shí)也是抗體人源化工作的基礎(chǔ)。
4.我們能夠?yàn)榭蛻籼峁└哔|(zhì)量的雜交瘤測(cè)序服務(wù)
標(biāo)準(zhǔn)周期單克隆抗體測(cè)序服務(wù)：抗體可變區(qū)VH和VL測(cè)序、抗體VH，VL和前導(dǎo)區(qū)測(cè)序、全抗體VH，VL，前導(dǎo)區(qū)和恒定區(qū)測(cè)序，3-4周完成測(cè)序服務(wù)。
快速單克隆抗體測(cè)序服務(wù)：從目標(biāo)細(xì)胞株快速識(shí)別的抗體序列，可在10天內(nèi)獲得測(cè)序結(jié)果。
5.為客戶提供雜交瘤測(cè)序服務(wù)的全流程介紹
雜交瘤測(cè)序服務(wù)，流程包括：RNA提取，cDNA克隆，T載體構(gòu)建，抗體基因測(cè)序，生物信息學(xué)分析，項(xiàng)目報(bào)告。
圖2：雜交瘤測(cè)序流程
5.1雜交瘤生產(chǎn)和總RNA提取根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol試劑從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA。
5.2反轉(zhuǎn)錄合成抗體可變區(qū)cDNA
5.2.1反轉(zhuǎn)錄
使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，另外使用的是RNA樣本（來(lái)自小鼠抗體的雜交瘤RNA樣本或來(lái)自嵌合抗體RNA樣本）、引物、10 mM脫氧核苷酸三磷酸混合物（dNTPs)、H2O和80U/μLRNAse抑制劑。注意：由于其RNA含量，將模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸分裝并儲(chǔ)存在–80℃。
根據(jù)以下方案執(zhí)行逆轉(zhuǎn)錄：在操作期間將所有反應(yīng)保持在冰上。對(duì)于每個(gè)RNA樣品，設(shè)置三個(gè)cDNA合成反應(yīng)：一個(gè)用于kappa鏈，一個(gè)用于lambda鏈，一個(gè)用于重鏈。理想情況下，每個(gè)抗體只會(huì)擴(kuò)增一條輕鏈。
圖3：3H4 kappa 和 3H4 lambda 可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列比較
5.2.1.1 在PCR管中，準(zhǔn)備Mix 1：2μL 50ng/μL RNA、1μL 10μM基于抗體鏈的反向RT引物（例如用于小鼠抗體的mIGKRT、mIGLRT或mIGHGRT）和1μL 10mM dNTP。對(duì)于一個(gè)RNA樣本，需要三管Mix1，每管包含不同的反向引物。
5.2.1.2 在0.5mL Eppendorf管中，配制Mix 2：1.95μL H2O、2μL 5x SMARTScribe緩沖液、1μL 20mM DTT和0.3μL 100μM模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸。為Mix2提供的體積用于一個(gè)cDNA合成反應(yīng)，因此根據(jù)需要進(jìn)行放大，即每個(gè)雜交瘤RNA樣品制備Mix 2體積的三倍。為所有反應(yīng)準(zhǔn)備了Mix 2的一種主混合物。
5.2.1.3 通過(guò)在熱循環(huán)儀中將含有Mix 1的試管在72℃下孵育3分鐘，使RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變性。
5.2.1.4在Mix 1變性期間，將以下物質(zhì)添加到Mix 2：每個(gè)cDNA合成反應(yīng)0.25μL 80U/μL RNAse抑制劑和0.5μL 100U/μL SMARTScribe逆轉(zhuǎn)錄酶。
5.2.1.5 將6μL Mix 2添加到每管變性Mix 1中。
5.2.1.6在熱循環(huán)儀中，合并的混合物在42℃下孵育60分鐘，然后在70℃下孵育5分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)保持在4℃。逆轉(zhuǎn)錄后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不需要cDNA純化步驟。
5.2.2 抗體可變區(qū)的PCR擴(kuò)增5.2.2.1為每個(gè)cDNA合成設(shè)置PCR反應(yīng)：10μL 5x PCR緩沖液，1μL 10mM dNTPs，3μL RT反應(yīng)合成的cDNA，2.5μL 10μM通用正向引物ISPCR，2.5μL 10μM反向PCR引物在抗體鏈上（例如小鼠抗體的mIGKPCR、mIGLPCR或mIGHGPCR）、30.5μL H2O和0.5μL 2U/μL Phusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。
5.2.2.2根據(jù)以下熱循環(huán)儀條件進(jìn)行降壓/降壓PCR：98℃ 30秒；98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒（每個(gè)循環(huán)降低溫度0.5℃）和72℃ 30秒的10個(gè)循環(huán)；98℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒15個(gè)循環(huán)；隨后72℃ 7分鐘；并保持在4℃。
5.2.2.3每個(gè)RT-PCR反應(yīng)取5μL在90V的TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上運(yùn)行。擴(kuò)增的小鼠抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在550-600個(gè)堿基對(duì)之間。擴(kuò)增的人抗體產(chǎn)物出現(xiàn)在750-850個(gè)堿基對(duì)之間。Quick Load Purple 2-Log DNA Ladder(NEB,N0550S)用作標(biāo)準(zhǔn)品。
圖4：抗體可變區(qū)PCR擴(kuò)增
5.3 T載體構(gòu)建
使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝膠提取試劑盒對(duì)RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行PCR清理。根據(jù)平末端克隆試劑盒手冊(cè)，將2μL的每個(gè)PCR清洗的產(chǎn)物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO載體中。接下來(lái)，將每個(gè)TOPO克隆反應(yīng)的3μL轉(zhuǎn)化為化學(xué)感受態(tài)E.Coli。將每個(gè)轉(zhuǎn)化的100μL涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育過(guò)夜。
5.4 抗體基因測(cè)序
獲得菌落后，將每條抗體鏈5-10個(gè)菌落接種在5mL LB/卡那霉素培養(yǎng)基中，并在37℃下以250rpm搖動(dòng)過(guò)夜。這些培養(yǎng)物使用Macherey-Nagel的小量制備試劑盒進(jìn)行小量制備，所得質(zhì)粒DNA由Sequetech Corporation使用M13正向引物進(jìn)行Sanger測(cè)序。
5.5生物信息學(xué)分析
使用 GitHub 上提供的自定義 Python 程序分析測(cè)序數(shù)據(jù)，去除非功能性的DNA。
5.6項(xiàng)目報(bào)告
交付得到的抗體序列。
