通過計算機斷層掃描（CT）鑒別診斷肺部結節在臨床實踐中具有挑戰性，現今仍有必要開發可靠、方便的生物標志物，早期正確識別肺癌，并在最初發現時區分大多數良性結節，以便對惡性腫瘤展開后續治療。

2023年4月24日，中山大學胡寓旻、劉萬里和欒天罡團隊在國際知名期刊Nature Communications上正式發表了題為“Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera”的研究性文章，該研究表征了480份血清樣本的代謝組，包括健康對照，良性肺結節和I期肺腺癌。腺癌組具有明顯的代謝組學特征，而良性結節和健康對照組在代謝組學譜上表現出相似性。該研究證實了血清代謝物生物標志物在CT篩查肺結節風險評估中的價值。

血清代謝組學分析

本研究采用非靶向代謝組學，通過高分辨液相色譜-串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）對174個健康對照組（HC）、170個良性肺結節組（BN）和136個I期肺腺癌組（LA）的血清樣本進行分析。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）圖中，LA與BN組、LA與HC組之間有明顯的代謝組學特征分離趨勢。而在BN與HC組之間分組不明顯。LA與HC組之間有382個差異代謝物，LA與BN組之間有231個，BN與HC之間有95個（Wilcoxon秩和檢驗，FDR < 0.05且FC值> 1.2或< 0.83），根據m/z值、保留時間和質譜碎片的進一步篩選，最終在LA和BN組和LA 和HC組之間，確定了33個和38個顯著差異代謝物。考慮到在肺腺癌亞型中表皮生長因子受體（EGFR）的基因突變較常見，本研究分析了肺腺癌組中72例具有可用EGFR狀態信息的病例樣本的整體代謝組學特征，發現有7個代謝物在EGFR突變型患者與EGFR野生型患者之間的代謝豐度顯著改變（VIP＞1，p < 0.05，FC > 1.2或 < 0.83）。7個代謝物中有5個是酰基肉堿，在脂肪酸氧化途徑中起重要作用。

圖1. 與健康對照和良性結節相比，肺腺癌的血清代謝組存在顯著差異

開發、優化和驗證差異血清代謝物的分類模型

在LA（n = 136）與BN（n = 170）組之間鑒定到的33個差異代謝物的基礎上，通過二元邏輯回歸建立代謝物生物指標模型，采用十折交叉驗證（10-fold cross validation）來測試模型的穩健性。在內部驗證（n = 104）和外部驗證（n = 111）隊列中分別進行代謝組學分析，以驗證分類模型的分類性能。在發現隊列(n = 306)中鑒定了27種代謝物，進行ROC分析得到AUC（Area Under Curve）為0.933（AUC值越接近1，表示分類器性能越好），以及0.868的敏感性和0.859的特異性。

該分類模型在內部驗證隊列和外部驗證隊列中得到了進一步的驗證。在內部驗證隊列中，AUC為0.915（敏感性0.867，特異性0.811），而在外部驗證隊列中，AUC為0.945（敏感性0.810，特異性0.979）。將外部隊列中的40個樣本在外部實驗室進行了分析，分類準確性AUC為0.925。由于鱗狀細胞肺癌（LUSC）是非小細胞肺癌（NSCLC）中僅次于腺癌的第二常見亞型，該研究還測試了經驗證的代謝標志物在由74例BN和16例LUSC組成的隊列中的潛在適用性。對于LUSC vs BN的區分，AUC為0.776，相比于LUAD vs BN的區分能力較弱，表明該方法不適用于LUSC篩查。

圖2. 用于區分良惡性肺結節的血清代謝分類模型的開發和驗證

血清代謝分類模型對同尺寸結節的診斷能力

在CT圖像上，結節大小與惡性概率呈正相關，并仍是結節管理的主要決定因素。直徑大于6mm且沒有明顯良性特征的結節被稱為不確定性肺結節（IPN），在臨床實踐中仍然是評估和管理的主要挑戰。通過合并來自發現組和內部驗證組的樣本，進一步研究了結節大小對代謝組學特征的影響。首先比較了直徑小于6mm的健康對照組和良性結節的代謝組學主成分分析（PCA），發現大部分數據點重疊在健康對照組和良性結節之間，顯示兩組血清代謝物含量的相似性，而在直徑為6-20mm的惡性結節之間觀察到了兩組間分離，該隊列在預測直徑6-20mm的結節的惡性率時，達到了0.927的AUC，0.868的特異性和0.820的靈敏性。結果表明，這一分類器可能能夠捕捉早期惡性轉化引起的代謝變化，無論結節大小如何。

圖3. 血清代謝分類器對相同大小范圍內結節的預測效果

色氨酸代謝變化與肺腺癌的主動糖酵解有關

通過MetaboAnalyst進行的KEGG通路富集分析顯示，在兩個給定組（LA對比HC和LA對比BN）之間存在6個常見的顯著改變的通路，包括丙酮酸代謝、色氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、糖酵解、TCA循環和嘌呤代謝。通過三重四極桿質譜儀(QQQ)進行靶向代謝組學研究，絕對定量驗證主要的代謝變化，確認了LA組相對于BN組和HC組中升高的次黃嘌呤、黃嘌呤、丙酮和乳酸水平；同時，BN組和HC組之間這些代謝物沒有顯著差異。

考慮到LA組色氨酸代謝的顯著影響，評估了所有組中的血清色氨酸水平，發現LA組的血清色氨酸含量較HC組和BN組顯著降低（p < 0.001），這與之前的研究結果相符，即與健康對照組相比，肺癌患者的循環色氨酸水平較低。另一項使用11C-甲基-L-色氨酸作為PET/CT示蹤劑的研究表明，與良性病變或正常組織相比，肺癌組織中色氨酸信號的滯留明顯延長。由此推測，LA組血清色氨酸的降低可能反映了色氨酸被活躍地攝取到肺癌細胞中。

已知色氨酸代謝的最終產物是NAD+，它是糖酵解中丙酮酸-3-磷酸和1,3-二磷酸甘油酸反應的必需底物。SLC7A5是色氨酸轉運蛋白。喹啉酸磷酸核糖轉移酶（QPRT）是在色氨酸代謝途徑下游將喹啉酸轉化為NAMN的酶。對LUAD的TCGA數據集的調查顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中SLC7A5和QPRT均顯著上調。在I&II期和III&IV期的肺腺癌中均觀察到這種升高，表明與腫瘤發生相關的色氨酸代謝異常出現在早期。

此外，LUAD-TCGA數據集顯示癌癥患者樣本中SLC7A5和GAPDH mRNA表達呈正相關。相反，在正常肺組織中這兩種基因標記之間沒有顯著相關性。在A549細胞中敲除SLC7A5后，色氨酸和NAD(H)的細胞水平顯著降低，導致胞外酸化率（ECAR）的下降，表明糖酵解活性的減弱。因此，基于血清代謝變化和體外實驗，表明色氨酸代謝可能通過kynurenine犬尿氨酸途徑產生NAD+在促進肺癌的糖酵解過程中起重要作用。

圖4. 肺腺癌色氨酸代謝與糖酵解活性的相關性

小結和展望

肺腺癌（LUAD）和鱗狀細胞癌（LUSC）是非小細胞肺癌（NSCLC）的兩種主要亞型。由于LUSC與吸煙有很高的關聯性，而LUAD是CT篩查中檢測到的偶然發現的肺結節中最常見的組織學類型，因此分類器模型是專門建立在I期腺癌樣本上的，因而在預測LUSC時準確性較低（AUC 0.776），這表明LUAD和LUSC可能存在各自的代謝組學特征。已有研究表明LUAD和LUSC在病因、生物學起源和基因異常方面存在差異。因此，在篩查項目的一般人群中，應該將其他類型的組織學類型納入分類模型，以便檢測肺癌。

該研究觀察到肺腺癌患者血清中丙酮和色氨酸代謝之間存在負向相關。與HC組或BN組相比，LA組的血清色氨酸水平降低。推測肺腺癌患者血清色氨酸的耗竭可能反映了對該代謝物的快速消耗。已知通過色氨酸的犬尿酸途徑進行的色氨酸代謝的最終產物是新生NAD+的來源。由于大部分NAD+是通過回收途徑產生的，色氨酸代謝中NAD+的相關性在健康和疾病中仍需進一步研究。對TCGA數據庫的分析顯示，色氨酸轉運蛋白7A5（SLC7A5）在肺腺癌中明顯上調，與糖酵解酶GAPDH的表達呈正相關。先前的研究集中于色氨酸代謝對抑制抗腫瘤免疫反應的作用。該研究證明了通過敲除肺癌細胞中SLC7A5來抑制色氨酸攝取，導致細胞NAD水平降低以及糖酵解活性減弱。因此，該研究為肺腺癌的惡性轉化所關聯的血清代謝改變提供了實驗依據。

綜上所述，該研究建立了用于肺結節鑒別診斷的血清代謝分類器，并提出了一種基于CT篩查的優化工作流程，以便進行風險評估并促進臨床管理。

參考文獻

Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera. Nature Communications. 2023.

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