在植物中，5mC DNA甲基化修飾（簡稱5mC甲基化）是一個重要而保守的表觀基因標記，參與基因組穩定性、基因轉錄調控、發育調控、非生物脅迫響應、代謝物合成等多種調控。茶樹（Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）是一種缺乏成熟遺傳轉化系統的非模式作物，迄今為止，對這種重要飲料植物的表觀遺傳學維度的研究很少。5mC甲基化在茶樹生長發育（采前加工）以及采前和采后加工中風味物質合成中的作用尚不清楚。
 
2023年08月01日，中國農業科學院農業基因組所孔維龍為第一作者和通訊作者、中國農業科學院農業基因組所張興坦研究員為共同通訊作者在《Hortic. Res.》雜志在線發表了題為“5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.)”的研究論文，該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和對應的轉錄組測序分析等實驗揭示了5mC DNA甲基化修飾介導的茶樹組織功能分化和重要風味物質合成調控機制。
標題：5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.)（5mC DNA甲基化修飾介導的茶樹組織功能分化和重要風味物質合成調控）
發表期刊：Horticulture Research      
發表日期：2023年08月01日    
影響因子：IF 8.7/ 1區
技術：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、RNA-seq、代謝組等

樣品及方法：
以國家品種“鐵觀音”烏龍茶為材料，采葉標準為一芽二葉或三葉。所有新鮮的葉子都在下午4點左右采摘（新鮮樣本）。收獲后的鮮葉先在陽光下萎凋35分鐘，然后轉移到室內萎凋15分鐘（萎凋處理樣本）。萎凋后，用搖床以25 r/min對茶葉進行三次搖動（搖動處理樣本）。隨機采集100g樣品作為新鮮、萎凋和搖動的三個處理樣品，每個處理設置三個獨立的生物學重復。共收集9個樣本進行代謝組、RNA-seq和WGBS-seq測序。
 
摘要
本研究應用無偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）對烏龍茶采摘后加工過程中的四個關鍵采前組織（根、葉、花和果）和兩個加工葉片進行了全面的DNA甲基化分析。分析結果表明，四個關鍵組織之間的差異性5mC甲基化與組織功能分化密切相關，并且與非組織特異性表達基因相比，負責組織特異性功能的組織特異性基因維持相對較低的5mC甲基水平。根中CsAlaDC和TS/GS基因的低甲基化修飾為根中茶氨酸（theanine）的顯性合成提供了分子基礎。此外，對采集后葉片的5mC DNA甲基化組學、代謝組學和轉錄組學的綜合分析表明，烏龍茶加工過程中風味代謝物含量變化與相應代謝物合成基因的轉錄水平變化密切相關，且這些重要合成基因的轉錄水平變化受5mC甲基化嚴格調控。進一步研究結果表明，加工過程中的一些關鍵基因受5mC甲基化調控，促進α-法尼烯（α-Farnesene）、橙花叔醇（nerolidol ）、脂質（lipids）和茶多酚（catechins）等味覺物質的重要香氣代謝物含量變化。本研究結果不僅闡明了5mC甲基化在采前和采后加工中重要風味物質合成中的關鍵作用，還為未來茶葉品質的改善或全組織高茶氨酸品種的選育提供了表觀突變相關基因靶點。
 
研究結果：
（1）5mC甲基化在茶樹采前組織功能分化中起重要調控作用
圖1：茶樹的四個關鍵采前組織中不同5mC甲基化水平
（A）不同組織的WGBS-seq數據的Pearson相關系數熱圖。
（B）組織中CHH、CHG和CG的甲基化水平。
（C）組織特異性表達基因數量。
（D）組織特異性和非組織特異性表達基因5mC甲基化水平差異。
（E）根組織特異性低甲基化基因的GO注釋。
 
 
 
（2）5mC甲基化參與調控茶樹根系中顯性茶氨酸合成和非生物脅迫響應


圖2：5mC甲基化參與調控茶樹根系中顯性茶氨酸合成和非生物脅迫響應。
（A） 茶氨酸合成的關鍵底物和基因。
（B） CsAlaDC和TS/GS基因在四種茶樹組織中的表達水平。
（C） 四種茶樹組織中CsAlaDC和TS/GS基因的甲基化水平。
（D） CsAlaDC和TS/GS基因在四種茶樹組織中的相對表達水平。
（E） 保守CHH高甲基化基因和低甲基化基因的GO注釋。
 

（3）烏龍茶采后加工過程中應激引起的代謝物變化
圖3：烏龍茶采后加工過程中代謝物的變化。
（A） 1377種次生代謝物的分類。
（B） UPLC–MS/MS檢測非揮發性代謝物含量的相關結果。
（C） GC–MS檢測揮發性代謝物含量的相關性結果。
（D） 三個加工處理點所有代謝物的總含量變化。
（E） 三個加工處理點不同類別代謝物含量的變化。
（F） 各加工點新出現的代謝物。


（4）烏龍茶采后加工過程中差異代謝物及差異表達基因的鑒定

圖4：烏龍茶采后加工中的差異代謝物（DMs）和差異表達基因（DEGs）。
（A） 不同加工處理點之間的次生代謝物差異。
（B） 所有差異次生代謝物的K-均值聚類。
（C） 各子類的詞云圖（Word cloud map）。
（D） 主要香氣物質含量變化熱圖。
（E） 重要茶多酚含量變化熱圖。
（F） 不同處理點之間的DEG數量。
（G） DEG的KEGG富集通路。
C：新鮮茶葉；W：萎凋處理茶葉；T：搖動處理茶葉。
 

（5）烏龍茶采后加工中的單堿基分辨5mC甲基化模式
圖5：烏龍茶三個重要加工處理點的單堿基分辨5mC DNA甲基化圖譜。
（A） 基因密度（a）、轉座子密度（b）、GC含量（c）、CG、CHH和CHG 5mC甲基化水平（d-f）和基因表達水平（g）的Circos圖。在d–g中，從外到內依次為：新鮮茶葉、萎凋處理茶葉和搖動處理茶葉。
（B） 烏龍茶三個重要加工處理點的DNA甲基化水平。
（C） 烏龍茶三個加工處理點的甲基化胞嘧啶數量。
（D） 每個加工點5mC甲基化水平分類。
（E） 三個不同加工點的基因和轉座子甲基化水平。
C和D中：C1–C3，新鮮茶葉；W1–W3，萎凋處理茶葉；T1–T3，搖動處理茶葉。


（6）5mC甲基化參與采后加工中風味物質相關基因表達的表觀調控
圖6：烏龍茶加工過程中DMR和DMR介導的DEG。
（A） DMR的數量。
（B） DMR在基因組中的位置分布。
（C） DMR介導的DEG數量。
（D） DMR介導的與重要風味物質相關的DEG基因表達水平熱圖。
（E） 橙花叔醇合成酶（NES）基因的WGBS-seq（CHH）和RNA-seq數據的IGV（Integrative Genomics Viewer）可視化。（F） WGBS-seq（CHH）的IGV可視化和4-coumaroyl-CoA (CsTGY13G0000351)基因的RNA-seq數據。


參考文獻：
Kong W, Zhu Q, Zhang Q, Zhu Y, Yang J, Chai K, Lei W, Jiang M, Zhang S, Lin J, Zhang X. 5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.). Hortic Res. 2023 Aug;10(8):uhad126.