文獻(xiàn)信息

北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京大學(xué)第一醫(yī)院團(tuán)隊(duì)合作得研究成果“Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates(非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸作為雙生物正交處理一鍋制備蛋白質(zhì)多綴合物)”在學(xué)術(shù)期刊Nature Communications(影響因子17.694)發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物PET/CT(型號(hào)：Super Nova)產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為北京大學(xué)藥學(xué)院劉濤教授和北京大學(xué)第一醫(yī)院楊興教授。北京大學(xué)藥學(xué)院劉濤教授團(tuán)隊(duì)博士后王永，碩士研究生韓伯陽以及北京大學(xué)第一醫(yī)院楊興教授團(tuán)隊(duì)博士研究生張景明為該文的共同第一作者。團(tuán)隊(duì)成員譚琳致，蔡文康，李雨軒，蘇曄宇，余宇彤，王昕，段小江，王浩宇以及天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室儀器平臺(tái)指導(dǎo)老師師曉萌，王靜，醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心儀器平臺(tái)指導(dǎo)老師鐘麗君等也為該研究做出了重要貢獻(xiàn)。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金《多層次手性物質(zhì)的精準(zhǔn)構(gòu)筑重大研究》，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)專項(xiàng)，北京大學(xué)臨床+X青年專項(xiàng)，以及北京市杰出青年基金等科研項(xiàng)目的大力支持。

文獻(xiàn)背景

治療性蛋白質(zhì)，比如抗體，激素，干擾素，白細(xì)胞介素，酶等等在各類疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，但是這些天然蛋白由于成藥性的缺陷，如療效差，半衰期短，系統(tǒng)性用藥毒性大，免疫原性高等問題，難以滿足當(dāng)前科研和臨床的需求。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾逐漸成為一種重要的對(duì)其成藥性進(jìn)行改造的手段。蛋白質(zhì)的雙修飾或者多修飾在實(shí)現(xiàn)多功能蛋白藥物的開發(fā)方面變得尤為重要。

用于位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)修飾的非匿名氨基酸(ncAA)的遺傳編碼已廣泛應(yīng)用于許多生物學(xué)和治療應(yīng)用。為了有效地制備均勻的蛋白質(zhì)多綴合物，作者設(shè)計(jì)了兩種可編碼的非編碼氨基酸(ncAAs)，4-(6-(3-疊氮基丙基)-s-四嗪-3-基)苯丙氨酸(pTAF)和3-(6-(-3-疊氮基)-s-三嗪-3-基苯基)苯丙氨酸(mTAF)，它們包含相互正交和生物正交的疊氮和四嗪反應(yīng)手柄。含有TAFs的重組蛋白和抗體片段可以以即插即用的方式與市售熒光團(tuán)、放射性同位素、PEGs和藥物的組合在一鍋反應(yīng)中容易地功能化，以提供蛋白雙綴合物，以評(píng)估小鼠模型中腫瘤診斷、圖像引導(dǎo)手術(shù)和靶向治療的組合。此外，作者證明，通過兩個(gè)無義密碼子將mTAF和含酮ncAA同時(shí)結(jié)合到一個(gè)蛋白質(zhì)中，可以制備位點(diǎn)特異性的蛋白質(zhì)三聯(lián)體。作者的結(jié)果表明，TAF是雙生物正交處理，可用于高效和可擴(kuò)展的多復(fù)合物制備。

實(shí)驗(yàn)方法

PET成像研究

⁶⁴Cu標(biāo)記的Fab-CY5-NOTA 22Rv1荷瘤小鼠(n=4)在100μL PBS緩沖液中靜脈注射3.70–4.44 MBq[⁶⁴Cu]Fab-CY5-NOTA。在相應(yīng)的成像時(shí)間之前，用2.5L/min的異氟烷麻醉小鼠，并將其放入micro-PET/CT掃描儀(Super Nova^®，平生醫(yī)療科技有限公司)。在注射后1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行PET/CT成像。使用Avatar軟件分析圖像(版本1.6.6.5)使用3D  OSEM+PSF算法重建PET數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

作者用雙模態(tài)抗體片段評(píng)估了連續(xù)PET和熒光成像的效果(圖4b)。將攜帶22Rv1腫瘤的小鼠靜脈注射3.7–4.44 MBq ⁶⁴Cu-J591Fab-CY5，并在不同時(shí)間點(diǎn)收集PET圖像。PSMA陽性的22Rv1腫瘤早在1小時(shí)p.i.就被特異性地觀察到，并在24小時(shí)p.i.內(nèi)持續(xù)可見。然后，作者還進(jìn)行了熒光成像和成像引導(dǎo)下的腫瘤切除術(shù)。在熒光圖像中清晰地觀察到22Rv1腫瘤，可以完全切除。在周圍正常組織中沒有觀察到明顯的熒光信號(hào)(圖4d)。用抗PSMA抗體對(duì)切除的腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光成像(圖4e)。

制備抗PSMA抗體片段雙綴合物，用于小鼠PSMA陽性腫瘤的顯微PET成像和熒光圖像引導(dǎo)手術(shù)。C注射⁶⁴CuJ591Fab-CY5后不同時(shí)間點(diǎn)皮下22Rv1腫瘤的顯微PET成像(由白色虛線圓圈表示)。

文獻(xiàn)結(jié)論

總之，作者開發(fā)了一個(gè)方便、多功能的平臺(tái)，通過GCE將含有兩個(gè)相互正交和生物正交反應(yīng)基團(tuán)的ncAA進(jìn)行位點(diǎn)特異性摻入，可以方便地獲得高產(chǎn)率的蛋白質(zhì)雙重和多重綴合物。該平臺(tái)可以很容易地用于利用市售的蛋白質(zhì)修飾試劑來擴(kuò)展蛋白質(zhì)的功能效用，從而使其成為研究將功能分子的各種組合附著到感興趣的蛋白質(zhì)上的后果的經(jīng)濟(jì)選擇。可以預(yù)期，該平臺(tái)對(duì)于擴(kuò)大基于蛋白質(zhì)的治療方法的范圍和產(chǎn)生治療方法(例如與抗體結(jié)合的各種藥物的組合)尤其有價(jià)值，這些藥物可以克服當(dāng)前可用的免疫治療的局限性。

使用設(shè)備

                                                      Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）