骨關節炎（OA）是最常見的慢性關節疾病，以關節軟骨的退行性變化和消失為特征。年齡、肥胖、代謝以及遺傳因素已被證明與OA的發生有關。過度的機械應變是OA發生的必要因素，包括拉伸、剪切和應變。在肥胖、創傷和關節不穩定等病理條件下，軟骨細胞對過度的機械應變作出反應，表現為細胞凋亡和炎癥反應，從而加速OA的進展。

機械敏感離子通道是細胞表面將機械力學刺激轉化為細胞內電信號或化學信號的機械感受器。壓電型機械敏感離子通道組件1（Piezo1）在生長板軟骨細胞中發揮作用，并有助于發育過程中的軟骨形成和軟骨內骨化。此外，Piezo1對異常的機械刺激作出反應，導致軟骨細胞凋亡和衰老。然而，Piezo1在過度機械應變誘導的OA中的潛在作用和機制尚不清楚。

鈣是真核細胞中必不可少的第二信使，調控各種生理和生化過程，如合成代謝、表型維持和細胞凋亡。在OA軟骨中觀察到高鈣含量并引起軟骨基質降解。鈣調磷酸酶（Calcineurin，CaN）-活化T細胞（NFAT）核因子信號軸的是鈣下游的關鍵信號。CaN是一種對鈣濃度敏感的磷酸酶，可使高度磷酸化的NFAT因子去磷酸化并導致其核易位。激活的NFAT1有助于基質金屬酶和炎性細胞因子的表達，從而觸發OA。鑒于Piezo1響應機械應變傳遞鈣，因此推測機械應變通過Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸加重OA。

Gsmtx4是一種從狼蛛毒液中分離出來的肽，可以抑制Piezo1的活化。Gsmtx4在治療心肌梗死、遺傳性球形紅細胞增多癥和高血壓等多種疾病中的有益應用已有大量證據。因此，通過Gsmtx4靶向Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸對OA具有廣闊的治療潛力。

最近，在武漢大學人民醫院骨外科、中南醫院關節與運動醫學科的一項研究中，闡明了過度機械應變加重OA的潛在機制，研究結果表明，Piezo1是軟骨細胞中響應機械信號的基本分子，并通過CaN / NFAT1信號軸調節細胞凋亡和軟骨基質代謝，并且Gsmtx4可能是針對OA治療的有吸引力的藥物。相關內容發表在 International Journal of Molecular Sciences 題為“Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain”。
 

首先，為了確定Piezo1在OA軟骨中的表達，實驗收集了OA患者的關節軟骨組織，并在損傷或完整區域評估了Piezo1的表達，觀察到關節軟骨損傷區與完整區相比有明顯的軟骨退變（圖1 a）。免疫組織化學分析顯示，損傷區Piezo1蛋白水平較完整區升高（圖1 b）。類似的，發現Piezo1在手術誘導的OA大鼠關節軟骨中明顯上調（圖1 c、d）。

然后，從未成熟大鼠中分離軟骨細胞，以探索Piezo1在體外OA模型中的表達。過度的機械應變是OA發展的關鍵致病機制。因此，在體外張力系統中培養軟骨細胞，以模擬OA進展中經歷的過度機械應變。結果顯示，暴露于循環機械應變（1 Hz，20%）的軟骨細胞中，Piezo1的mRNA和蛋白水平以時間依賴性方式增加（圖1 e-g）。因此，可能是由于機械應變， Piezo1 的水平在 OA 的關節軟骨中上調，特別是在損傷區域。

圖1   Piezo1在OA患者和大鼠的關節軟骨中上調

接下來，實驗確定了Piezo1在機械應變信號轉導中的作用。明場圖像顯示，軟骨細胞的形態從多邊形變為紡錘形，并且在暴露于12小時的機械應變后出現凋亡小體。此外，機械應變以時間依賴性方式導致軟骨細胞凋亡以及合成代謝和分解代謝失衡。鑒于機械應變對軟骨細胞的影響在24 小時達到閾值，因此在后面的實驗中使用24 小時的機械應變。

Piezo1是感知軟骨細胞表面機械信號的關鍵蛋白。因此，si-Piezo1 在軟骨細胞上施用以確定 Piezo1 在機械信號轉導中的作用。結果表明，si-Piezo1可以降低Piezo1的mRNA水平。實驗發現，si-Piezo1 逆轉了機械應變引起的凋亡細胞比例的增加并改變了凋亡相關分子如BCL2相關X蛋白（BAX）和B細胞淋巴瘤/白血病-2 （BCL2）的表達。此外，si-Piezo1重新平衡了受機械應變破壞的軟骨基質合成代謝和分解代謝。

為了進一步確認Piezo1在機械信號傳導中的作用，用Yoda1處理軟骨細胞，Yoda1是一種有助于激活Piezo1的合成化合物。結果發現，Yoda1處理的效果與機械應變相似，呈現高比例的凋亡細胞，BAX，BCL2，MMP3，MMP13，COL2A1和聚集蛋白聚糖的表達改變。此外，si-Piezo1 可以減輕其對細胞凋亡或合成代謝/分解代謝失衡的影響。這些數據表明，機械應變通過上調和激活Piezo1誘導軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。
 

Piezo1激活后，細胞質中的鈣通過鈣內流增加。因此，實驗專注于鈣信號傳導的主要下游途徑，CaN/NFAT信號傳導軸，以闡明Piezo1誘導軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡的機制。結果表明，si-Piezo1抑制了機械應變引起的鈣內流和CaN的激活（圖2 a、b）。免疫熒光和蛋白質印跡結果表明，si-Piezo1逆轉了機械應變促進的NFAT1核易位（圖2 c、d）。接下來，在軟骨細胞上應用Yoda1，以進一步探索Piezo1對CaN / NFAT1信號軸的影響。與機械應變類似，Yoda1對鈣內流、CaN活性和NFAT1的核易位有積極影響，并被si-Piezo1逆轉（圖2 e-g）。這些數據表明，機械應變通過上調和激活Piezo1表達來激活CaN / NFAT1信號軸。

圖2   機械應變下的Piezo1激活CaN/NFAT1信號軸。

然后，為了評估Piezo1/CaN/NFAT1信號軸在機械信號轉導上的必要性，使用Gsmtx4、CaN抑制劑CsA和NFAT抑制劑VIVIT peptide 特異性阻斷CaN/NFAT1信號傳導軸的信號轉導。結果表明，Gsmtx4降低了細胞內鈣濃度，但幾乎不受CsA和VIVIT peptide的影響。同時，CsA和Gsmtx4都可以使機械應變處理的軟骨細胞中CaN失活。免疫熒光和蛋白質印跡結果顯示，Gsmtx4、CsA和VIVIT抑制NFAT1的核易位。最后，發現Gsmtx4，CsA和VIVIT可以保護軟骨細胞免受細胞凋亡以及合成代謝和分解代謝失衡。因此，Piezo1/CaN/NFAT1信號軸對于機械信號轉導是必需的，阻斷Piezo1/CaN/NFAT1信號軸可以保護軟骨細胞免受機械應變下的凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。

最后，研究人員試圖研究通過關節內注射Gsmtx4阻斷Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸對ACLT-誘導的OA大鼠的影響。實驗以兩種不同的頻率進行注射（H-Gsmtx4組每周一次，L-Gsmtx4組每兩周一次）（圖3 a）。結果顯示，術后8周ACLT組關節軟骨表面糜爛和蛋白聚糖丟失。與ACLT組相比，ACLT+L-Gsmtx4組和ACLT+H-Gsmtx4組關節軟骨破壞程度較輕，尤其是后者（圖3 b）。與ACLT組相比，Gsmtx4處理組的OARSI評分明顯較低，ACLT+H-Gsmtx4組低于ACLT+L-Gsmtx4組。此外，Gsmtx4降低了軟骨細胞的凋亡比例，且呈劑量依賴性（圖3 c）。免疫組織化學染色結果顯示，Gsmtx4注射降低了ACLT誘導OA模型中MMP3和MMP13的表達，增加了COL2A1和聚集蛋白聚糖的表達（圖3 d）。其中，高頻率關節內注射Gsmtx4表現出較好的療效。這些數據表明，Gsmtx4可以通過抑制細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡來改善大鼠的OA。

圖3   大鼠關節內注射Gsmtx4可改善OA。

圖4   Gsmtx4在過度機械應變下緩解OA的分子機制示意圖。

總之，該研究證明了Piezo1在機械應變下上調和激活，并通過CaN / NFAT1信號軸引起軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。Piezo1抑制劑Gsmtx4在體內和體外均可緩解OA。結果支持Piezo1 / CaN / NFAT1可能是OA的有希望的治療靶點。

參考文獻：Ren X, Zhuang H, Li B, Jiang F, Zhang Y, Zhou P. Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4022. doi: 10.3390/ijms24044022. PMID: 36835440; PMCID: PMC9961447.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36835440/
 

小編旨在分享、學習、交流生物科學等域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用。