CRISPR/Cas是近幾年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最火的技術(shù)之一，可控性和通過修改sgRNA靶點(diǎn)就能改變Cas9切割位點(diǎn)的便捷性使CRISPR/Cas的研究如火如荼，該技術(shù)的潛力不言而喻，但是脫靶效應(yīng)的潛在危險(xiǎn)和臨床運(yùn)送載體效果不佳制約著CRISPR/Cas的發(fā)展。
 

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近幾年，研究人員已經(jīng)通過改進(jìn)Cas酶、優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)、預(yù)測靶向結(jié)果和對基因表達(dá)時(shí)空調(diào)控等手段很大程度上降低了脫靶效應(yīng)，而優(yōu)化運(yùn)送Cas系統(tǒng)的載體仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，最近鄭州大學(xué)藥學(xué)院張開翔教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一篇名為“Biomimetic Mineralized CRISPR/Cas RNA Nanoparticles for Efficient Tumor-Specific Multiplex Gene Editing”的文章，有望解決體內(nèi)多組分RNA遞送的難點(diǎn)，為基于RNA的CRISPR/Cas9基因編輯提供了一種新策略。
 

Mg2+在RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起主要作用，并通過參與RNA與核糖體的結(jié)合促進(jìn)RNA翻譯，Mg2PPi（焦磷酸鎂）是核酸合成過程中常見的副產(chǎn)物，利用焦磷酸酶可以有效溶解Mg2PPi的特性，確保遞送載體的RNA在細(xì)胞內(nèi)的有效釋放。以RNA為模板的Mg2PPi晶體的成核和生長可以將Cas9 mRNA、sgSurvivin、sgPLK1和sgHPV以所需的化學(xué)量包埋在單個(gè)納米顆粒（稱為多基因編輯RNF）內(nèi)，用聚乙烯亞胺（PEI）凝聚納米顆粒，并涂以透明質(zhì)酸（HA）。該Mg2PPi仿生礦化一體化載體系統(tǒng)為基于RNA的多重基因編輯在體內(nèi)的應(yīng)用提供了一種潛在的策略。
 

該研究通過一系列實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)果：

1）當(dāng)EGFP mRNA濃度為666ng/μL時(shí)，形成的仿生礦化納米顆粒（890nm）相對較小，包封效率高（88.75%）；
2）透射電鏡（TEM）顯示，由EGFP mRNA合成的仿生礦化納米顆粒大小分布均勻，并保留了清晰的花狀結(jié)構(gòu)；
3）元素圖譜證實(shí)了EGFP RNF中存在C、N、O、Mg和P，這說明EGFP RNF可能由mRNA和Mg2PPi組成，表明mRNA在顆粒內(nèi)成功結(jié)合；
4）以RNA為模板的Mg2PPi仿生礦化過程不會破壞Mg2PPi的晶體結(jié)構(gòu)，并且RNA被均勻地納入晶體中；
5）瓊脂糖凝膠電泳分析表明，焦磷酸酶能有效分解EGFP RNF，釋放EGFP mRNA；
6）轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示EGFP RNF在HeLa細(xì)胞中熒光明顯，保留了表達(dá)蛋白質(zhì)的能力；
7）仿生礦化RNA納米顆粒具有優(yōu)越的RNA裝載和保存特性。比脂質(zhì)納米顆粒（LNP）高8-9倍的RNA負(fù)載能力，EGFP RNF在4°C下放置1個(gè)月或在-20°C下放置6個(gè)月后仍然保持形態(tài)穩(wěn)定，在4℃下保存35天后表達(dá)能力沒有下降；
8）仿生礦化RNA遞送策略是通用并可擴(kuò)展的；
9）EGFP mRNA NPs的轉(zhuǎn)染效率高于EGFP mRNA@ PEI；
 

10）EGFP基因編輯（NPs）成功地將所有CRISPR/ Cas9 RNA組分傳遞到人類癌細(xì)胞系中，實(shí)現(xiàn)了EGFP的高效基因組編輯；

11）多基因編輯NPs不僅可以在三個(gè)位點(diǎn)自主進(jìn)行基因編輯，而且在基因編輯后對HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出良好的誘導(dǎo)凋亡作用；
12）多基因編輯NPs在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了有效的多重基因組編輯。與對照組相比多基因編輯NPs治療可顯著抑制腫瘤生長，腫瘤體積減少78%，腫瘤重量減少4%，多基因編輯NPs后腫瘤組織細(xì)胞密度降低，凋亡顯著增加；

13）仿生礦化RNA納米顆粒可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)非肝臟部位的精確靶向，同時(shí)避免LNP在肝臟的攔截，在主要器官中檢測到的基因破壞事件幾乎可以忽略不計(jì)，靜脈注射多基因編輯NPs后12小時(shí)，在腫瘤部位觀察到最大信號；

14）多基因編輯NPs在不引起小鼠主要器官的基因破壞和病理改變的情況下實(shí)現(xiàn)了高效的多基因編輯，作為納米載體具有較高的生物安全性。

單基因編輯不足以改變動物表型，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物學(xué)應(yīng)用通常需要同時(shí)干擾多個(gè)基因位點(diǎn)，CRISPR同時(shí)靶向多個(gè)基因的能力是一個(gè)顯著的優(yōu)勢，該研究創(chuàng)立的Mg2PPi仿生礦化一體化載體系統(tǒng)是一種簡單廉價(jià)的方法，不需要復(fù)雜的原材料或昂貴的設(shè)備，適合低成本批量生產(chǎn)和多種應(yīng)用，為有效的mRNA遞送提供了另一種解決方案，有望促進(jìn)基于mRNA的治療在體內(nèi)的應(yīng)用。