研究結(jié)果
1. scRNA-seq檢測到數(shù)量更多的細(xì)胞和基因，尤其是免疫相關(guān)基因，而snRNA-seq受線粒體污染的影響較小，檢測到更多種類轉(zhuǎn)錄因子。
scRNA-seq中定位到外顯子區(qū)域的讀數(shù)的比例為56.4%，顯著高于snRNA-seq，其中讀數(shù)更多地定位到內(nèi)含子區(qū)域；scRNA-seq中的counts或基因數(shù)量高于snRNA-seq，但是snRNA-seq中每個細(xì)胞的線粒體讀數(shù)的平均百分比低于scRNA-seq；對scRNA-seq和snRNA-seq中前100個高度可變基因的GO富集分析表明，snRNA-seq鑒定出更多與表皮發(fā)育相關(guān)的基因，而scRNA-seq則鑒定出更多的與免疫功能相關(guān)的基因；通過分析scRNA-seq和snRNA-seq檢測到的轉(zhuǎn)錄因子的差異，發(fā)現(xiàn)snRNA-seq可以檢測到更多的轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)。
 

2 . snRNA-seq和scRNA-seq在檢測細(xì)胞類型方面存在差異
由于scRNA-seq的不同消化方案可能導(dǎo)致細(xì)胞比例的變化，研究整合了已發(fā)表文章中健康皮膚的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。使用這些綜合數(shù)據(jù)，鑒定出了13個細(xì)胞類型簇。研究使用已知的特征基因確定了每個簇的同一性；snRNA-seq對角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的檢測更有效，而scRNA-seq檢測出更多種類的免疫細(xì)胞；消化時間和不同類型的消化酶對scRNA-seq中的細(xì)胞活性和基因表達(dá)有不同的影響。在He等人的數(shù)據(jù)中，用混合酶消化整個皮膚，與本研究的scRNA-seq和Reynolds等人的數(shù)據(jù)相比，獲得了更多的角質(zhì)形成細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞亞群。本研究和Reynolds等人在37°C下使用膠原酶IV過夜對真皮進(jìn)行了消化，則獲得了大量的免疫細(xì)胞和FIB1。相反，He等人的消化時間很短，成纖維細(xì)胞亞群和免疫細(xì)胞的百分比更接近snRNA-seq.
 

3. snRNA-seq揭示了更多與角質(zhì)形成細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞簇
本研究基于snRNA-seq的結(jié)果，對角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行了二級無監(jiān)督聚類，并通過特征基因和GO富集分析鑒定了8個亞聚類。皮膚形態(tài)發(fā)生相關(guān)的“基底”（高表達(dá)COL17A1、KRT15和KRT14）細(xì)胞；角質(zhì)形成細(xì)胞分化和角質(zhì)形成相關(guān)的“棘狀”（高表達(dá)KRT1和中等表達(dá)KRT10）和“顆粒狀”（高度表達(dá)LOR、FLG和SPINK5）；參與細(xì)胞連接組裝的 “通道間隙”（表達(dá)GJB2和GJB6）細(xì)胞；ATP代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞連接的離子通道相關(guān)的“通道ATP酶”（表達(dá)ATP1A1和P1B1）細(xì)胞；角質(zhì)形成細(xì)胞分化和細(xì)胞連接的過程相關(guān)“毛囊（外根鞘）”（表達(dá)KRT6A、KRT6B和KRT17）細(xì)胞；脂肪酸代謝以分泌皮脂相關(guān)的“毛囊（內(nèi)鞘（IR）-皮脂腺）”（表達(dá)KRT79、ELOVL5和FASN）細(xì)胞；有絲分裂核分裂相關(guān)的“有絲分裂”（表達(dá)UBE2C、TOP2A和MKI67）。這些亞群很好地概括了角質(zhì)形成細(xì)胞的空間和功能聚類；利用snRNA-seq中角質(zhì)形成細(xì)胞亞群的分群方法對scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)兩種方法中，角質(zhì)形成細(xì)胞子群的比例不平衡。在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，功能性角質(zhì)形成細(xì)胞的比例顯著降低，包括“通道ATP酶”、“通道間隙”、“棘狀”和“有絲分裂”細(xì)胞。
 

4. snRNA-seq鑒定出調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞分化的基因
由于角質(zhì)形成細(xì)胞的分化狀態(tài)與亞群密切相關(guān)，本研究通過偽時間分析探究了角質(zhì)形成細(xì)胞分化過程。“基底”細(xì)胞被定義為起點(diǎn)，五個譜系被識別為代表不同的軌跡。沿著這些軌跡，本研究發(fā)現(xiàn)了代表角質(zhì)形成細(xì)胞分化特定階段的新標(biāo)志物。例如，LYPD3和EMP2的表達(dá)隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的角質(zhì)化而增加；CSTB主要在毛囊外根鞘周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)；結(jié)合人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫，證實(shí)了這些基因在原位皮膚中的蛋白質(zhì)表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組分析一致；“基底”和“毛囊（外根鞘）”細(xì)胞高表達(dá)NFIB，用于維持干細(xì)胞特性并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期；GRHL1在分化軌跡末端表達(dá)逐漸增多，表明其參與角質(zhì)形成細(xì)胞的功能分化。在HPA數(shù)據(jù)庫中，NFIB主要在正常皮膚和基底細(xì)胞癌（BCC）的“基底”角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)。GRHL1在正常皮膚的基底上角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，但在cSCC中不表達(dá)。
 

5. snRNA-seq揭示穩(wěn)態(tài)下的人類成纖維細(xì)胞圖譜
由于成纖維細(xì)胞在解離過程中會發(fā)生顯著變化，本研究在集成數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了二級無監(jiān)督聚類，進(jìn)一步的確定了其異質(zhì)性；與scRNA-seq相比，snRNA-seq中的亞簇?cái)?shù)量顯著較低；根據(jù)位置和功能（分泌性乳頭狀細(xì)胞、分泌性網(wǎng)狀細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和促炎細(xì)胞），并結(jié)合最近提出的四個亞群的特征基因，進(jìn)一步定義了成纖維細(xì)胞的亞群；促炎性成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)特征主要局限于C1-C5中的成纖維細(xì)胞，且僅在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，表明酶消化可能激活成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)炎癥表型。C1和C3具有乳頭狀成纖維細(xì)胞的特征；C2主要表現(xiàn)為網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞的特征；C4和C8主要表現(xiàn)出間充質(zhì)特征。C0、C6和C9主要存在于snRNA-seq數(shù)據(jù)中。這三個亞群共享Pi16+成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞。C7高表達(dá)PI16和DPT，這是泛成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞的兩個標(biāo)志物，并被選為成纖維細(xì)胞軌跡分析的起點(diǎn)。Slingshot譜系推斷確定了從PI16+簇中出現(xiàn)并在兩個方向上結(jié)束的五個軌跡：穩(wěn)定簇或激活簇，表示皮膚成纖維細(xì)胞在穩(wěn)定或激活狀態(tài)下的分化軌跡。狀態(tài)特異性特化成纖維細(xì)胞與分級聚類分析完全一致，表明scRNA-seq中的單細(xì)胞分離可能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的炎癥激活，而snRNA-seq反映了成纖維細(xì)胞在原位的穩(wěn)定狀態(tài)。

6. scRNA-seq和snRNA-seq在識別皮膚中的免疫細(xì)胞方面是互補(bǔ)的：scRNA-seq具有更大的檢測免疫細(xì)胞的能力；而snRNA-seq在檢測某些稀有細(xì)胞方面更為優(yōu)越
本研究分析了包括DC、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞在內(nèi)的主要免疫細(xì)胞基因表達(dá)的變化。scRNA-seq和snRNA-seq都揭示了DC和巨噬細(xì)胞中常見的抗原呈遞細(xì)胞（APC）功能，包括細(xì)胞因子產(chǎn)生、白細(xì)胞趨化性和T細(xì)胞活化的陽性調(diào)節(jié)。然而，scRNA-seq展現(xiàn)出更多的免疫相關(guān)功能，如“對脂多糖的反應(yīng)”，并且該GO術(shù)語中的大多數(shù)基因編碼有效或功能性分子。scRNA-seq還鑒定出比snRNA-seq數(shù)量高得多的CCR7⁺CD40⁺遷移APC，但幾乎沒有檢測到任何LC；而snRNA-seq可以鑒定少量的LC；研究還發(fā)現(xiàn)，scRNA-seq和snRNA-seq都檢測出大量與T細(xì)胞功能相關(guān)的生物學(xué)過程。其中，scRNA-seq鑒定了罕見的駐留T細(xì)胞。編碼分泌細(xì)胞因子、表面標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄因子（RORA除外）的T細(xì)胞亞群相關(guān)基因的豐度在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中遠(yuǎn)高于snRNA-seq。
 

本研究所使用的伯優(yōu)^®細(xì)胞核分離試劑盒是由伯豪生物獨(dú)立研究開發(fā)的產(chǎn)品。

產(chǎn)品優(yōu)勢
最大限度地維持細(xì)胞核膜的完整和染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得率高，雜質(zhì)少，不易成團(tuán)。

產(chǎn)品應(yīng)用
表觀遺傳學(xué)研究（如scATAC- seq/bulk ATAC- seq，CUT&Tag）；
核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq/bulk RNA-seq）等；

結(jié)果參考 

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