文獻信息

近日，昆明醫科大學附屬口腔醫院云南口腔醫學重點實驗室、昆明醫科大學附屬口腔醫院正畸科團隊的研究成果“Small extracellular vesicles from dental follicle stem cells provide biochemical cues for periodontal tissue regeneration（牙囊干細胞的細胞外小泡為牙周組織再生提供生化線索 ）在雜志Stem Cell Research & Therapy（IF：6.832 ）上發表。平生公司的離活一體Micro CT（NEMO）在論文中提供了重要的大鼠牙周組織圖像。

該研究的共同通訊作者為胡江天、楊禾豐，共同第一作者為馬麗婭、饒南荃。

文獻摘要

背景：基于干細胞衍生的細胞外小囊泡（SEV）療法已被探索作為牙周再生干細胞移植療法的替代方案。牙囊干細胞（DFSCs）在再生醫學中具有巨大的應用潛力。然而，目前尚不清楚DFSC衍生的SEV（DFSCs-SEV）是否可用于牙周再生。本研究旨在探討DFSCs-sEVs能否再生受損的牙周組織及其潛在的機制。

方法：分離鑒定DFSCs-sEVs，并將其與牙周膜干細胞（PDLSCs）共培養。使用EdU分析、CCK-8分析、細胞周期分析、劃痕實驗、茜素紅染色、qRT-PCR和western blot分析，檢測DFSCs-sEVs對PDLSCs生物學行為的影響。RNA測序和功能富集分析用于檢測DFSCs-sEVs對PDLSCs影響的信號通路。用ERK1/2或p38 MAPK抑制劑預處理PDLSC，以研究ERK1/2和p38 MAPK通路參與的可能性。此外，將DFSCs-sEVs與膠原海綿復合移植到SD大鼠牙周組織缺損處，然后用蘇木精-伊紅（HE）染色和Micro CT檢查牙周組織的病理變化。

結果：PDLSCs可內化DFSCs-sEVs，從而通過EdU分析、CCK-8分析和細胞周期分析促進細胞增殖。DFSCs-SEV顯著增強了PDLSC的遷移。DFSCs-sEVs促進PDLSC的成骨分化，顯示出深茜素紅染色、成骨基因上調（RUNX2，BSP，COL1）和蛋白表達上調（RUNX2，BSP，COL1，ALP）。作者發現DFSCs-sEVs激活了p38 MAPK信號通路。特異性抑制劑（SB202190）對該信號通路的抑制部分削弱了被DFSCs-sEVs增強的增殖能力。DFSCs-sEVs移植后，大鼠牙周損傷區可見新的牙周膜樣結構和骨形成。在新形成的牙周膜和缺損區軟組織中觀察到標記的DFSCs-SEV。

結論：作者的研究表明，DFSCs-sEVs通過促進PDLSC的增殖、遷移和成骨分化，促進牙周組織再生。

實驗方法

大鼠牙周缺損模型

本研究共使用72只12周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。允許動物自由獲取水和食物，并將其保存在受控環境中（50%濕度、25°C和12小時的明暗循環）。所有動物隨機分為3組：空白組（未治療，n=24）；膠原蛋白海綿組（CS，n=24）；膠原海綿組負載DFSCs-sEVs（CS-sEVs，n=24）。如前所述，在大鼠第一磨牙的牙周組織上造成牙周缺損（3×2×1 mm）。按照各組對大鼠進行治療，并在術后2周、4周和8周采集下頜骨樣本。

Micro CT分析

收集的樣本用4%多聚甲醛固定24小時。接下來，使用Micro CT系統（NEMO，NMC-100，中國昆山平生醫療有限公司）進行采集。使用以下參數掃描下頜下磨牙區域：90 kV電壓和60μA電流。重建數據，并使用Avatar 1.5.0軟件（PINGSENG Healthcare Inc.）分析缺損區域的骨體積/組織體積（BV/TV）比和小梁厚度（Tb.Th）。

實驗結果

Micro CT結果顯示，三組移植后2周未見牙周膜樣組織和新骨形成，移植后4周可見新骨形成。移植4周后，膠原海綿組形成分散的新骨碎片，而DFSCs-sEVs組觀察到彌漫性骨形成，與其他2組相比，DFSCs-sEVs組觀察到更密集的新骨形成（圖7D）。此外，作者發現DFSC-sEVs組在術后2周的小梁厚度明顯高于未治療組（圖7E）。此外，三組移植后2、4、8周，DFSCs-sEVs組牙骨質與新骨之間均有不同程度的牙周膜樣組織。間隔4周后，與其他兩組相比，DFSCs-sEVs組顯示出高度細胞化的牙周組織，細胞垂直于牙骨質和牙槽骨，呈現出最多的愈合跡象，這與Micro CT結果一致。未治療組和膠原海綿組均有結締組織形成。然而，沒有一種膠原纖維具有條紋，這些條紋是牙周膜的一個顯著特征，有序排列并嵌入牙骨質之間，覆蓋牙根和牙槽骨窩內壁（圖7F）。為了探討DFSCs-SEV的定位和存活，將PKH26標記的DFSCs-SEV移植到大鼠牙周缺損區。移植2周后，在新形成的牙周膜和缺損區軟組織中觀察到標記的DFSCs-SEV，而移植4周后觀察到標記較少的DFSCs-SEV（圖7B，C）。這表明DFSCs-sEVs參與了大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣組織和新骨的形成。

DFSCs-sEVs促進大鼠牙周組織再生。A體內實驗設計。B DFSC-SEV的體內定位。細胞核用DAPI（藍色）染色，DFSC-SEV用PKH26（紅色）標記。白色箭頭顯示DFSCs-SEV。C DFSC-SEV的量化。D具有代表性的顯微CT重建圖像顯示2-8周時不同組的新骨形成。定量微CT評估BV/TV（%）、Tb。Th（毫米）。F牙周再生的組織學評價。CS，膠原海綿；nb，新骨；nPDL，新牙周膜；d：牙本質*p＜0.05,**p<0.01

文獻結論

在本研究中，DFSCs-sEVs通過促進PDLSCs的增殖、遷移和成骨分化，促進大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣結構和新骨的形成；這些生理過程可能部分歸因于p38 MAPK信號通路的激活。作者的發現為牙周組織再生中無細胞治療策略的發展提供了實驗基礎。

使用設備

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫療科技）