基于CRISPR/Cas9系統的不同基因編輯方法已經廣泛應用于哺乳動物細胞系中，而在魚類細胞系中進行遺傳操作的研究較少。利用CRISPR/Cas9進行細胞系基因編輯主要包括以下幾個步驟：如靶向目的基因的gRNA設計、細胞轉染、基因編輯效率的確定、單細胞克隆的建立，以及突變細胞系的特征鑒定等。每個過程都需要克服相應的障礙，特別是對于魚類細胞系，以低轉染效率聞名。相比哺乳動物細胞系，魚類細胞系的培養溫度較低、細胞膜磷脂飽和度較高，使得磷脂雙分子層更加堅硬，外源DNA進入細胞更加困難。
 

雖然利用病毒載體進行質粒傳遞的方式具有較高的轉染效率，但是病毒載體存在兩個缺點：一是CRISPR/Cas9元件的長時間表達會導致脫靶效應的概率增加，二是病毒DNA可能會整合到宿主基因組中而導致插入突變事件。此外，由于鮭科魚類細胞生長緩慢以及魚類單克隆細胞系培養困難，此前還沒有分離經過基因編輯的虹鱒魚（Oncorhynchus mykis）克隆細胞系。為了便于在魚類細胞系中進行遺傳操作，瑞士聯邦水產科學和技術研究所、蘇黎世大學實驗動物科學研究所及環境系統科學系的Marina Zoppo和Nicole Okoniewski等人在Cell & Bioscience期刊上發表了題為“A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells”的研究論文。在本研究中，作者以在虹鱒魚腸道細胞系RTgutGC中敲除cyp1a1基因為例，建立了一種基于CRISPR/Cas9系統的基因編輯魚類細胞系的方法，并獲得了cyp1a1基因突變的單克隆細胞系。
 

 

本次實驗中，研究人員使用了NEPA GENE公司的NEPA21高效基因轉染系統對RTgutGC細胞進行電穿孔。為確定最適合RTgutGC細胞電穿孔的參數，設置了11次電穿孔條件，當參數為電壓150V、脈沖時間5ms、脈沖間隔50ms、脈沖次數2次的程序時，轉染效率最高，經過優化后標準質粒（pEGFP-C1-Flag）的轉染效率可達到78%。
 

隨后，研究人員先將cas9蛋白與crRNA:tracrRNA-ATTO™550雙鏈合成核糖核蛋白（RNP）復合物（圖1a）。采用上述電穿孔參數，對RTgutGC細胞進行電穿孔并將RNP復合物導入到細胞內，用以敲除cyp1a1基因（圖1b）。電穿孔48h后，使用ATTO™550信號進行流式細胞儀分選，并在96孔板中培養后依次傳到更大的細胞培養孔板上，以便提取細胞基因組DNA進行基因分型。最后，采用T7內切酶（T7EI）分析和ICE分析分別評估CRISPR/Cas9誘導的基因編輯效率和突變的性質，最后通過低密度接種和克隆環細胞分離法獲得克隆細胞（圖1b）。
 

圖1 在RTgutGC細胞中轉染核糖核蛋白（RNP）復合物。a. RNP的合成過程；b.細胞電轉染及CRISPR/Cas9基因編輯流程。

研究人員對cyp1a1基因的crRNA分析表明，cyp1a3中存在一個假定的脫靶位點，cyp1a3是一個屬于CYP1A亞家族的基因，與目標基因cyp1a1有96%的核苷酸同源性。但是在PAM近端區域存在單個堿基對錯配，這表明可能不會發生脫靶切割現象。T7EI檢測結果顯示，未轉染RNP的細胞cyp1a1擴增產物只有一條與野生型產物對應的DNA條帶。但是轉染RNP的細胞cyp1a1擴增產物被切割成三條帶，對其DNA條帶強度進行評估，cyp1a1的基因編輯效率約為39%（圖2a-b）。此外，從轉染RNP和未轉染RNP細胞中擴增出cyp1a3基因，未檢測到切割產物，表明結果與預期相符（圖2b）。

此外，作者從轉染和未轉染的RTgutGC細胞中擴增出RNP復合體靶向的cyp1a1 DNA區域，并進行Sanger測序。結果表明，在crRNA靶向的區域有重疊的峰，進一步證實了cyp1a1基因的編輯（圖2b）。同時，使用ICE分析表明，在Cas9切割位點檢測到不同長度的基因插入或缺失（從−5核苷酸到+1核苷酸），與非同源性末端連接（NHEJ）修復途徑相兼容（圖2c）。ICE分析cyp1a1基因的總體編輯效率為34%，與Sanger測序之間具有良好的相關性（R²=0.98）。
 

圖2 RTgutGC細胞轉染后進行T7E1檢測和ICE分析。a. 左側為T7EI檢測示意圖；右側為T7E1檢測結果，（1）RNP轉染組RTgutGC細胞的cyp1a1；（2）未轉染組RTgutGC細胞的cyp1a1；（3）RNP轉染組RTgutGC細胞的cyp1a3；（4）未轉染組RTgutGC細胞的cyp1a3；（5）T7E1檢測陽性對照；每個泳道上的數據為基因編輯效率。b. Sanger測序結果。c. 電轉染RNP細胞的ICE分析結果。

值得一提的是，作者本想通過流式細胞儀分選法或連續稀釋法分離出經基因編輯的RTgutGC細胞克隆，但均以失敗告終。最后，采用了克隆環細胞分離法成功分離出兩株cyp1a1基因突變的RTgutGC細胞系。作者分析可能主要存在兩個因素：一是魚類細胞系生長緩慢，二是細胞培養過程中需要其他細胞釋放生長因子。經鑒定，兩株cyp1a1基因突變細胞系分別在PAM序列之前的第3個核苷酸發生1個和101個核苷酸的插入，均導致了cyp1a1 ORF的移碼，使得終止密碼子提前。
 

在本研究中，作者借助NEPA GENE品牌的NEPA21基因高效轉染系統，將RNP復合物導入難轉染的魚類細胞系RTgutGC中，成功地開發了一種CRISPR/Cas9方法來編輯虹鱒細胞系RTgutGC，以及一種分離經過基因編輯的克隆細胞的方法。這是首次報道虹鱒CRISPR編輯的克隆細胞系，為將來分離虹鱒魚和其他魚類細胞系的克隆細胞奠定了基礎。

NEPA21基因高效轉染系統采用全新設計的電轉程序，電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因導入+反向導入模式。不需要特殊轉染試劑輔助，節省實驗成本；電轉程序中的各項參數實時可見、可調，特別適用于優化原代細胞、非常見細胞的電轉參數。
 

論文鏈接：

https://linkspringer.53yu.com/article/10.1186/s13578-021-00618-0

參考文獻：

Zoppo M, Okoniewski N, Pantelyushin S, et al. A ribonucleoprotein transfection strategy for CRISPR/Cas9‐mediated gene editing and single cell cloning in rainbow trout cells[J]. Cell & Bioscience, 2021, 11(1): 103.

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