大腸桿菌是重組蛋白(RPs)最有效的表達宿主之一。具有表達系統(tǒng)清晰、培養(yǎng)成本低、操作簡單、生長速度快等優(yōu)勢。被廣泛應用于生物制藥領域。

高細胞密度發(fā)酵是指在一定的培養(yǎng)體系內，利用改變培養(yǎng)方式或培養(yǎng)條件的方法，提高菌體生物培養(yǎng)密度，進而增加目標產物產量。

影響因素主要有：

① 培養(yǎng)基成分

② 菌種接種量

③ 培養(yǎng)溫度

④ 發(fā)酵液pH

⑤ 溶氧

⑥ 補料策略

⑦ 誘導方式

⑧ 生長抑制物的積累

01  實驗使用的設備

Bioreactor

本實驗采用迪必爾生物的一次性生物反應器（3L）系統(tǒng)，包含了最大體積為3L的一次性硬質發(fā)酵罐體和T&J-Intelli-Ferm A系列控制器（圖1）。

圖1 T&J-Intelli-Ferm A 臺式生物反應器

該系統(tǒng)符合cGMP藥品生產規(guī)范。具有易于安裝的特點，且兼容玻璃罐體配件，可快速轉移研發(fā)管線（圖2），提高工藝開發(fā)效率，讓研究者只需關注工藝開發(fā)。

圖2 一次性罐體結構

02  實驗過程

Process

兩次測試工作體積均為1.5L，接種量為工作體積的2%，并在發(fā)酵運行9h左右開始補料，24h結束培養(yǎng)，最終OD₆₀₀分別達到84、79，驗證了一次性生物反應器（3L）能為大腸桿菌提供適宜的生長環(huán)境，滿足大腸桿菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵過程中的溶氧變化可以反應菌株的生長情況。從接種開始，溶氧隨發(fā)酵進行逐漸降低，當溶氧低于設定值30%時觸發(fā)溶氧關聯，攪拌、通氣逐漸上升，直至溶氧值突然激增，此時發(fā)酵液內營養(yǎng)物質消耗殆盡，開啟補料關聯控制。此后在理想狀態(tài)下溶氧會在設定值附近波動（圖2），若溶氧波動較大則需要調整補料策略，如更改補料速度、補料關聯模式。

圖2 兩次實驗溫度、溶氧、pH變化曲線

03  實驗結論

Conclusion

OD₆₀₀可以反應菌種的密度。若OD₆₀₀上升變緩或開始下降，則表明菌株已進入生長末期，可以結束批次培養(yǎng)。

經過24h的發(fā)酵培養(yǎng)，第一次實驗菌株OD₆₀₀從搖瓶2.56增加至84，第二次實驗菌株OD₆₀₀從搖瓶1.62增加至79，均有較高的增殖（表1）。

表1 兩次實驗各階段OD₆₀₀數值

本次實驗使用基礎培養(yǎng)基，未添加微量元素、生物素等。兩批菌株經過24h的培養(yǎng)，在裝液量1.5L、接種量2%的條件下，都有較好的生長。在同等工藝條件下，迪必爾一次性生物反應器（3L）能達到玻璃生物反應器同等水平。

實驗說明大腸桿菌在迪必爾一次性生物反應器（圖3）能有較好的生長，實驗中一次性生物反應器系統(tǒng)的溫度、pH控制較為平穩(wěn)，溶氧波動較小，能為菌株提供良好的生長環(huán)境。

圖3 迪必爾一次性生物反應器（3L）系統(tǒng)

實驗使用的T&J-Intelli-Ferm A系列控制器，罐體從3L到15L可選，軟件界面整合了多種補料策略及DO級聯方式，是理想的縮小及放大應用發(fā)酵罐，適于所有的微生物培養(yǎng)，可輕松做到高密度發(fā)酵培養(yǎng)。