文獻信息

近日，甘肅農業大學生命科學技術學院、中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院基礎醫學實驗室、甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室共同合作的研究成果“阿侖膦酸鈉對去卵巢小鼠骨質量及臟器病理學的影響”在學術期刊《海南醫學院學報》上發表。平生公司的Micro-CT(型號：NMC-200)產品為論文提供了重要的小鼠股骨Micro-CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為甘肅農業大學生命科學技術學院陳克明教授。第一作者為甘肅農業大學生命科學技術學院在讀研究生王龍飛。

文獻摘要

探究阿侖膦酸鈉對去卵巢小鼠骨質量和臟器病理學的影響

實驗目的：將30只SPF級C57雌性小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為假手術組(Sham)，去卵巢組(OVX)和去卵巢+阿侖膦酸鈉組(ALN)，ALN組每周阿侖磷酸鈉400µg/kg 皮下注射2次，Sham組和OVX組每周等體積的生理鹽水皮下注射2次，給藥12周后取材，分別觀察臟器系數、主要臟器病理學切片、骨組織病理學切片、分析micro CT、L4椎體生物力學和血清生化指標。

實驗結果：Sham組子宮系數(0.0054±0.0007)顯著高于OVX組(0.0026±0.0009)和ALN組(0.0025±0.0007)小鼠的子宮系數，差異具有統計學意義(P<0.05)。主要臟器未發現明顯的病變和毒副作用。骨組織脫鈣切片ALN組與OVX 組相比骨小梁結構致密，脂肪細胞較少。micro CT結果顯示，ALN組的Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.BV/TV與OVX組相比，均有顯著性增加，但Tb.Sp數值顯著性減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。L4 zhui體生物力學中ALN組的彈性模量(50.29±13.43)和最大載荷數(29.83±4.92)顯著高于OVX組的彈性模量(14.77±3.12)和最大載荷數(11.57±3.18)，差異具有統計學意義(P<0.05)。ALN組血清中骨形成指標OCN和PINP OVX組相比都呈上升趨勢，骨吸收指標TRACP-5b和CTX-I都呈下降趨勢，差異具有統計學意義(P<0.05)。

實驗結論：阿侖膦酸鈉可能是通過增加骨密度、改善骨微結構、提高骨強度、促進骨形成、抑制骨吸收從而提高骨質量，并且對臟器沒有明顯的毒副作用。

實驗方法

實驗動物與分組處理

8周齡SPF級C57BL/6小鼠30只，體重(18±2)g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜)2019-001。飼養于聯勤保障部隊第九四〇醫院SPF 級動物實驗中心，許可證編號：SYXK(軍)2017-0047。小鼠造模前按隨機數字表法分為3組，每組10只，分別為假手術組(Sham)、去卵巢組(OVX)及去卵巢+阿侖膦酸鈉組(ALN)。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外，其余各組均由背部行雙側卵巢摘除術。術后連續肌注3天青霉素。ALN組每周阿侖磷酸鈉400µg/kg皮下注射次，Sham組和OVX組每周等體積的生理鹽水皮下注射2次。為防止切卵巢后小鼠體重上升過快，每天給小鼠定量喂食，所有小鼠的喂食量按照假手術組每天進食量給予，術后周開始給藥。實驗期間注意皮毛的色澤、觀察小鼠生理反應與生活習性的變化，每一周稱一次體重。給藥第12周處死小鼠取材，取材前禁食不禁水24小時。

Micro CT分析

小鼠取材時，每組隨機挑出6根左側股骨固定在4%多聚甲醛中。固定好的樣本存放于4℃冰箱內。實驗時，用鑷子取出樣本并用紗布擦走多余的液體后，用干凈的紙巾將樣品包裹放入Micro CT設備中。掃描后得到大量層切圖片，再經重建軟件進行3D重建，截取最大剖面圖與橫截面圖。選擇骨骺線下1mm至1.5mm處為感興趣區進行分析，得到分析區域松質骨的骨形態參數。選擇骨 骺線下 2.5mm至3mm處為感興趣區進行分析，得出該區域皮質骨的骨形態參數。得到橫截面圖、最大剖面圖以及骨形態參數包括骨小梁骨密度(Tb.BMD)、骨小梁數(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積分數(Tb.BV/TV)、皮質骨密度(Ct.BMD)和皮質骨厚度(Ct.Th)。

實驗結果

Micro CT 掃描及分析

股骨正中剖面圖(圖3)顯示，OVX組與Sham組相比，松質骨比較疏松， 骨小梁數量減少，骨小梁間間距擴大，骨小梁與骨小梁間的連續性與延展性較差。其中ALN組與Sham組相比，股骨松質骨的骨微結構質量基本一致。從骨小梁橫切圖(圖4)顯示，OVX組骨小梁比較稀疏，Sham組和ALN組明顯更加緊密。從骨小梁3D圖(圖5)看出OVX組骨小梁數目明顯較少，Sham組和ALN組骨小梁數目明顯較多。從皮質骨3D圖(圖6)和皮質骨橫切(圖7)未發現OVX組與Sham組和ALN組的明顯差異。

由表2可見，通過比較松質骨和皮質骨的骨形態參數，發現ALN組的小鼠與OVX組小鼠比較，數值在Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th 和Tb.BV/TV均有顯著性增加、Tb.Sp數值顯著性減少(P＜0.01)，證明ALN提高骨質量，是通過增加骨密度和改善骨組織的結構。ALN組與OVX組的Ct.BMD和Ct.Th比較無統計學差異(P>0.05)。

圖3  小鼠股骨Micro CT成像分析最大剖面圖

 
圖4  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁橫切 

 
圖5  小鼠股骨Micro CT成像分析骨小梁3D

圖6 小鼠股骨Micro CT成像分析皮質骨3D

圖7  小鼠股骨Micro CT成像分析皮質骨橫切

文獻結論

Micro CT是骨組織微觀結構鑒定的新方法，可以從三維層面精準地反映皮質骨與松質骨的微結構。Micro CT有直觀、準確和靈敏度高等特點，是骨科基礎疾病研究常用的一種有效的可靠手段，特別在骨質疏松癥相關的大小鼠實驗中運用最多。本次以實驗小鼠股骨為對象，分析最大剖面圖與立體三維重建圖，通過二維和三維的角度分析小鼠股骨的微觀結構并得到準確的松質骨和皮質骨量化指標結果。直觀體現松質骨和皮質骨的微觀構造，同樣得到皮質骨和松質骨量化數值。Micro CT結果顯示，ALN都能增加骨小梁數量、加大骨小量厚度、減小骨小梁間距、加強骨小梁的連續性，使得松質骨內部的骨小量更加緊致，在微觀層面加強骨質量并提高骨強度。說明ALN可以預防小鼠切卵巢引起骨的丟失，增加骨質量。

    Micro CT（型號：NEMO）（平生醫療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫療科技）