不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力研究
包括干細胞在內的細胞治療產品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應用。
為了使細胞產品成功應用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細胞內結冰對細胞結構的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經上市。常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細胞毒性。據報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應的報道。此外，已知DMSO會通過調節三種DNA甲基轉移酶(Dnmts)的轉錄水平和改變全基因組甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發高效無毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。
海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應有關，也與細胞膜磷脂和不穩定蛋白的特異性相互作用有關，可防止其因干燥和氧化應激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞(hESCs) 和人類誘導多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應用的主要障礙是其難以進入細胞內部。以前已經應用了幾種方法，如滲透休克、脂質體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導致細胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯合，配制了4種不同的海藻糖復合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復蘇，對幾個關鍵參數進行了治療研究，包括細胞形態、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩定性、內質網(ER)穩態、DNA損傷反應等，以衡量不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。
1. 不同冷凍保護劑組成
所有冷凍保護劑均現用現配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實驗中用到的細胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無血清，無動物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類多能干細胞(hPSCs)的冷凍保護劑。
2. 細胞的冷凍保存及解凍
細胞在特定條件下培養，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細胞類型的包被培養容器上。
3. 結果與討論
①細胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復蘇后的活力并與對照組進行比對。結果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進行冷凍保存及復蘇，進行細胞冷凍復蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進行比較。
當細胞海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時，解凍后的細胞恢復率降低，不同干細胞類型的細胞恢復率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎的培養基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實驗結果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯合作用的結果。
這些結果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過早分化的風險。
②細胞形態
干細胞凍存另一個重點關注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細胞內外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進而誘導染色體異常分離，導致細胞生長特征和形態變化。因此，可通過觀察凍存復蘇后的細胞形態來較為直觀地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態。相位對比圖像證實，在所有細胞系中，海藻糖復合冷凍保護劑均未引起明顯的形態變化，細胞形態與CS10中保存的細胞相同。
③標志物表達水平
為了確認凍存復蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關鍵性質和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標記物的表達水平。
對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進行比對。
對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進行比對。結果顯示干細胞分化潛能未受影響。
④染色體穩定性
為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩定性的影響，對所有三種干細胞系進行常規核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結果。
總體而言核型保持穩定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過程中隨機產生的，而不是冷凍保存導致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結構染色體畸變。
⑤內質網應激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細胞響應內質網應激和UPR通路的能力產生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態下維持穩態，ER整合了各種分子和細胞信號。內質網應激和UPR都介導影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。
總體而言，與對照組CS10相比，內質網應激/UPR反應水平適中。一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細胞內質網（ER）穩態。
為了使細胞產品成功應用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的治療可用方法。為了避免細胞內結冰對細胞結構的損害，一些生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑已經上市。常用的生物制劑凍干保護劑，冷凍保護劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯合使用。
然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患。此外，DMSO具有細胞毒性。據報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應的報道。此外，已知DMSO會通過調節三種DNA甲基轉移酶(Dnmts)的轉錄水平和改變全基因組甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發高效無毒的生物制劑凍干保護劑，細胞冷凍保護劑。
海藻糖生物制劑凍干保護劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在完全脫水狀態下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應有關，也與細胞膜磷脂和不穩定蛋白的特異性相互作用有關，可防止其因干燥和氧化應激而損傷和變性。
海藻糖生物制劑凍干保護劑不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞(hESCs) 和人類誘導多能干細胞(hiPSCs) 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。
阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應用的主要障礙是其難以進入細胞內部。以前已經應用了幾種方法，如滲透休克、脂質體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導致細胞損傷。
該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯合，配制了4種不同的海藻糖復合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復蘇，對幾個關鍵參數進行了治療研究，包括細胞形態、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩定性、內質網(ER)穩態、DNA損傷反應等，以衡量不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。
1. 不同冷凍保護劑組成
| 組別 | 成分 |
| A | 0.5M 海藻糖 |
| B | 0.5M 海藻糖+2.5% 乙二醇 |
| C | 0.5M 海藻糖+10% 乙二醇 |
| D | 0.5M 海藻糖+10% 甘油 |
2. 細胞的冷凍保存及解凍
細胞在特定條件下培養，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細胞在每種冷凍保護劑1.5 mL中重懸，然后轉移到低溫小瓶中。
低溫小瓶使用冷凍容器進行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過夜后，轉移到- 80°C冰箱。再24小時后，將低溫小瓶轉移到液氮中，并在分析前存儲至少一周。
解凍時，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團消失，細胞懸液用溫暖的培養基稀釋。以200g離心3分鐘收集細胞，并以指定的接種量將其接種到適合每種細胞類型的包被培養容器上。
3. 結果與討論
①細胞活力
解凍48 h后，用阿拉瑪藍法測定細胞活力。
首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨使用時的適宜用量。在不同干細胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測試細胞復蘇后的活力并與對照組進行比對。結果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細胞類型之間存在很大的差異。
確定初始濃度后，選定4種冷凍保護劑配方（詳見上文），對三種干細胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進行冷凍保存及復蘇，進行細胞冷凍復蘇后活力檢測。并將細胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細胞在相同條件下進行比較。
當細胞海藻糖(冷凍保護劑A組)冷凍保存時，解凍后的細胞恢復率降低，不同干細胞類型的細胞恢復率從20%到60%不等。
在以海藻糖為基礎的培養基中添加10% 乙二醇或甘油時(冷凍保護劑C組、D組)，RC17和AF22細胞的細胞存活率都達到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細胞存活率優于乙二醇。
此外，對比由乙二醇或甘油組成的對照冷凍溶液的實驗結果，可以確認細胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯合作用的結果。
這些結果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可提高海藻糖冷凍保護劑的存活率。與對照組CS10相比，細胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護劑不含血清蛋白，避免了先前報道的刺激多能干細胞過早分化的風險。
②細胞形態
干細胞凍存另一個重點關注的問題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過程可能在細胞內外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進而誘導染色體異常分離，導致細胞生長特征和形態變化。因此，可通過觀察凍存復蘇后的細胞形態來較為直觀地評估干細胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。
上圖顯示了解凍48小時后RC17、CTR2#6和AF22的細胞形態。相位對比圖像證實，在所有細胞系中，海藻糖復合冷凍保護劑均未引起明顯的形態變化，細胞形態與CS10中保存的細胞相同。
③標志物表達水平
為了確認凍存復蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細胞的關鍵性質和特征，在解凍48 h后通過定量RT-PCR分析幾個標記物的表達水平。
對RC17和CTR2#6細胞檢測細胞標記Nanog, Oct4和Sox2。與對照組進行比對。
對AF22細胞檢測細胞標記Nestin和Sox2。與對照組進行比對。結果顯示干細胞分化潛能未受影響。
④染色體穩定性
為了評估海藻糖冷凍保護劑對干細胞染色體穩定性的影響，對所有三種干細胞系進行常規核型分型和aCGH，下圖為AF22細胞系儲存前后的結果。
總體而言核型保持穩定，但檢測到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經存在于原始細胞群中，另一些可能是在細胞體外操作過程中隨機產生的，而不是冷凍保存導致，因為在儲存前(圖C)和儲存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結構染色體畸變。
⑤內質網應激/未折疊蛋白水平評估
該研究還關注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會對多能細胞響應內質網應激和UPR通路的能力產生負面影響。為了在不同的生理或病理狀態下維持穩態，ER整合了各種分子和細胞信號。內質網應激和UPR都介導影響細胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機制。
總體而言，與對照組CS10相比，內質網應激/UPR反應水平適中。一種更敏感的細胞系是CTR2#6，在實驗組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會明顯改變多能干細胞內質網（ER）穩態。
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