艾滋病是一種危害性極大的病毒性傳染病，由人免疫缺陷病毒（HIV）引起。一般來說，HIV病毒在感染黏膜組織靶細胞后兩周內就會擴散到淋巴器官。進入發病期后，HIV病毒主要通過攻擊CD4+T淋巴細胞導致機體喪失免疫功能。感染組織微環境的原位解析能夠幫助我們更深入地理解HIV感染如何導致機體免疫失調，但傳統手段很難獲得感染組織的高參數病理結果，限制了研究的進展。近期，斯坦福大學的Garry Nolan教授研究團隊通過蛋白-核酸原位成像法實現了33種生物標志物檢測，建立了多組學空間表型分析體系，并在《Immunity》雜志上報道了HIV宿主淋巴組織免疫抑制微環境形成機制的研究成果[1]。
 
 
研究背景
 
艾滋病又叫獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），于1981年首次發現，是由于感染HIV病毒導致的 CD4+T淋巴細胞減少為代表特征的免疫衰竭綜合癥[2]。HIV感染后的平均潛伏期為8-10年，患者常于感染后 10-15年因并發各種機會性感染或惡性腫瘤而死亡。
 
近二十年來，抗逆轉錄病毒療法（ART）用于AIDS患者的治療取得了很好的效果。ART能完全抑制HIV的復制，改善免疫功能并大幅降低AIDS的病發風險。但是，ART不能根治AIDS，臨床數據表明，停藥后病毒總是可以在幾周內“卷土重來”[3]。體內HIV難以清除的主要障礙就是在HIV感染的過程中，病毒能夠潛伏在某個亞群的細胞中，形成HIV潛伏病毒庫(latent reservoir)。在潛伏病毒庫中，HIV通過隱藏在被感染細胞的基因組中逃避宿主免疫系統的監視，等待發病時機的到來。
 
目前，對于組織中潛伏病毒庫的研究手段多限于消化組織并進行單細胞檢測，再輔以原位雜交（ISH）和免疫組化。這種檢測手段無法深入解讀潛伏病毒庫及周圍細胞亞群的原位空間信息，限制了其研究的發展。這篇題為“Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments”的研究中，作者利用Akoya空間單細胞蛋白組技術，實現了低拷貝數病毒核酸和多種蛋白標志物的原位檢測，為我們提供了嶄新的研究視角。接下來我們就跟著作者的思路，從技術體系搭建和科學問題研究兩個方面來解讀本文的內容。
 
 
研究過程
 
作者首先面對的關鍵技術難題就是：如何能在同一張組織切片上同時檢測蛋白表位和微弱的病毒核酸（vDNA和vRNA）信號？研究選用了非人靈長類動物疾病模型，分別利用猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和新冠病毒（SARS-CoV-2）進行vDNA和vRNA造模。將核酸原位雜交技術（DNA/RNA Scope）與該課題組常用的幾種蛋白原位檢測技術（IF、Akoya的PhenoImager HT(原Vectra Polaris）、Akoya的空間單細胞蛋白組PhenoCycler（原CODEX)、MIBI）技術相結合，在細胞系（圖1B）和組織切片（圖1D和E）中實現了蛋白-核酸原位成像（簡稱PANINI）。值得一提的是，在實驗體系優化過程中，作者利用pH9抗原修復液有效保留樣本ISH敏感性的特點，突破了傳統方法樣本制備的技術壁壘。成功實現了一個樣本中31種蛋白和2種核酸（對vRNA和vDNA單拷貝級別精度）的檢測。
   
接下來，作者在超多標蛋白-核酸原位成像的基礎上對樣本進行空間表型分析，對比SIV感染組和對照組恒河猴淋巴組織中的細胞表型差異。33種標志物中包含：結構標志物（dsDNA，Histone H3，Pan-Keratin，SMA和Vimentin），核內功能標志物（FoxO1，FoxP3，Ki-67，Lamin AC，NF-κB-p100和Pax-5），細胞質內標志物（IL-10，granzyme B和CD25），髓系細胞功能標志物（CD11b，CD16，CD68，CD163和 DC-SIGN），免疫細胞分群標志物（CD21、CD36、CD45、CD56、CD138、HLA-DR 和 MPO），以及標記感染細胞的vDNA 和 vRNA。根據免疫細胞標志，作者得到樣本中14種細胞表型的分析結果（圖2）。
   
在對14種細胞亞群逐一分析的過程中，作者發現通過FOV細胞表型分析無法歸納出病毒感染之后免疫系統的調節規律。
 
該空間單細胞表型分析出場了！
 
作者的應對策略是采用細胞鄰域（Cellular Neighborhood，CN）分析，不僅關注細胞本身，還關注該細胞周圍的19個細胞（共20個細胞，圖3A），并對得到的信息加以k-means聚類分析（不考慮感染指標，圖3B），進而得到了11個有著獨特細胞分布特征的細胞鄰域（CN，圖3B）。在CN分類完成的基礎上，分析SIV感染導致的CN分布改變以及其中細胞的功能調節。這種細胞群體追蹤的方法讓作者找到了多個SIV感染后的微環境變化規律。在SIV感染導致的眾多CN變化中，作者發現病毒感染導致CN8（富含巨噬細胞和CD8+T細胞）取代CN3（富含巨噬細胞和CD4+T細胞）占據主導地位，同時巨噬細胞免疫抑制功能相關標志物（DC-SIGN，FoxO1，IL-10和CD169）陽性的細胞比例顯著升高。
   
接下來作者做了詳細的細胞-細胞分析以及CN-CN分析，對比SIV感染后組織重塑情況（圖4），進一步將關注點鎖定在富含B細胞的CN2和富含巨噬細胞的CN8上。至此，作者已經找出SIV感染事件中導致免疫失調的關鍵細胞：病毒依賴性B細胞和免疫抑制型巨噬細胞（詳細過程見原文）。
   
在隨后的功能性分析中，作者發現CN2中的B細胞和CN8中的巨噬細胞中IL-10陽性細胞比例顯著升高（圖5A）。一系列巧妙的實驗設計和檢測結果表明：SIV感染激活B細胞中FoxO1的表達，產生IL-10促進了巨噬細胞的M2型活化，進而形成免疫抑制微環境。
   
最后，作者還用蛋白-核酸原位成像技術進行了SIV病毒感染后組織特性的分析，找出了感染過程中幾個關鍵的標志物（CD56，IL-10，FoxO1，HLA-DR，CD21等）并提出了相應的原位多組學空間表型分析模型。不得不承認，這篇文章可謂是空間表型分析在艾滋病研究中應用的杰出典范。
 
Akoya空間單細胞蛋白組學PhenoCycler
華盈生物提供服務的Akoya空間單細胞蛋白組學PhenoCycle（原CODEX）技術平臺，采用專利的DNA偶聯抗體檢測技術結合自動化高分辨熒光顯微鏡，可還原蛋白質和特定細胞在組織中的真實分布。可實現近百種蛋白質的空間原位檢測。
 
技術優勢：
● 分辨率高，精確到0.251μm。
● 相比IMC，可實現全片掃描，無需預先限定感興趣區域（ROI）。
● >70種已驗證的DNA偶聯抗體可供自由選擇組合。
● 定制化更加靈活，可與商品化panel聯合使用。
 
相關文獻
1.Jiang S, Chan CN, X Rovira-Clavé, et al. Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments. 2022, Immunity 55, 1118–1134
2.JUNPO Hiv/Aids. 2006 Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva Switzerland Unaids Jun, 2004, 27(7):553-556.
3.Deeks, S., Overbaugh, J., Phillips, A. et al. HIV infection. 2015, Nat Rev Dis Primers 1, 15035.
該文章轉自：AkoyaBio微信公眾號