腎細胞癌（RCC）是最常見的腎癌亞型，每年超400萬例新發病例，是泌尿系統惡性腫瘤導致的第二大死因。2%-70%的RCC為透明細胞RCC（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。DNA甲基化（DNA methylation，DNAm）是主要的表觀遺傳修飾之一，在維持基因轉錄和基因組穩定性方面具有至關重要的作用。DNAm在ccRCC的發病機制中起著重要作用，許多研究集中于DNAm異常變化與ccRCC預后之間的相關性，但基于DNAm驅動基因的ccRCC預后模型鮮有報道。
 
2023年6月7日，南方醫科大學附屬龍華人民醫院泌尿外科鄧瓊研究員等在《BMC Genomics》發表題為“Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma“的研究論文，該研究以ccRCC患者的DNA為對象，通過簡化基因組重亞硫酸鹽測序（RRBS）等技術方法，鑒定出ccRCC患者的ccRCC早期診斷和預后的DNA甲基化生物標志物。
標題：Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma（基于DNA甲基化驅動基因的腎透明細胞癌預后模型的鑒定和驗證）
時間：2023-06-07
期刊：BMC Genomics
影響因子：IF 4.4
技術平臺：RRBS等

摘要：
腎透明細胞癌（ccRCC）是一種形態異質且預后不良的惡性腫瘤。本研究旨在建立DNA甲基化（DNAm）驅動的ccRCC基因預后模型。本研究對ccRCC患者的DNA提取物進行了RRBS測序分析。對10對患者樣本的RRBS數據進行分析以篩選候選CpG位點，然后訓練并驗證18個CpG位點模型，并結合臨床特征建立了用于ccRCC預后或風險評估的列線圖（Nomogram model）模型。研究在啟動子區域鑒定出2261個DMR。經DMR篩選后，共篩選出578個候選基因，與450K芯片中的408個CpG二核苷酸相對應。從TCGA數據集中收集了478個ccRCC樣本的DNAm圖譜。通過單因素Cox回歸、LASSO回歸和多因素Cox比例風險回歸分析對319個樣本的training集進行分析，共鑒定出18個CpG的預后組。結合臨床特征構建了預后模型，在測試集（test set，159個樣本）和整組（whole set，478個樣本）中，Kaplan-Meier曲線差異顯著；ROC曲線和生存分析顯示AUC＞0.7。結合臨床病理特征和甲基化風險評分的列線圖表現較好，決策曲線分析也顯示出有益的效果。
本研究深入了解了高甲基化在ccRCC中的作用。鑒定出的靶標可作為ccRCC早期診斷和預后判斷的生物標志物。本研究對更好的風險分層和個性化治療具有重要意義。
 
研究結果
（1）RRBS質控結果
表3：C和CpG位點甲基化和比對

表4：CG、CHG、CHH平均甲基化水平（>1X深度）

圖1：樣本間全基因組甲基化差異。

1. 樣本中CpG甲基化水平相關性。較大的圓形區域和較深的顏色表示高相關性。
2. 聚類樹狀圖。根據歐幾里得距離，使用R.Ward.d2的hclust函數對樣本進行聚類。選擇最小方差方法作為聚類方法

（2）DMR鑒定
圖2：DMR分析

1. 平均甲基化差異。X軸代表甲基化差異。負值表示低甲基化。正值表示高甲基化。Y軸表示相應橫坐標的DMR數量。
2. DMR甲基化分布密度。X軸代表Ca組中的DMR甲基化水平；Y軸代表對照組中的DMR甲基化水平。DMR密度從低到高（白色到紅色）。
3. DMR在基因元件上的分布

 
（3）ccRCC預后模型構建
圖3：差異甲基化CpG（differentially methylated CpG，dmCpG）位點鑒定。
A、 使用調諧參數（lambda）對CpG位點進行LASSO回歸分析。
B、 蛋白質-蛋白質互作。
C、 18個dmCpG位點的DisGeNet疾病富集分析。
D、 18個dmCpG位點的GO富集分析
 

表5：預后模型中18個CpG位點的注釋
 

（4）預后模型的Training

圖4：training集中的風險評分

1. 高風險組和低風險組患者的KM生存曲線。數據顯示為四分位間距的中位數。使用Log-rank檢驗評估統計學顯著性。虛線顯示50%生存概率的顯著性。
2. 計算高風險和低風險患者的風險評分和生存狀態等級。虛線顯示區分ccRCC高風險和低風險患者的臨界值。
3. C.18個CpG位點甲基化水平熱圖。
4. 風險評分的1年、3年、5年和10年ROC曲線。以臨界值決定該模型的敏感性和特異性

 
圖5：test集中的風險評分
 

（5）預后模型的驗證
圖6：基于預后模型和臨床特征的列線圖
預后模型和臨床特征的單因素（A）和多因素（B）回歸分析。（C）預測ccRCC患者1年、3年、5年和10年生存時間概率列線圖
 


圖7：模型校準和ROC評估

1. 高風險組和低風險組患者的KM生存曲線。
2. 預測ccRCC患者1年、3年、5年和10年總生存期（OS）的列線圖。

C-F.  1年（C）、3年（D）、5年（E）、10年（F）的臨床病理特征（綠色，與腫瘤分期診斷、年齡和腫瘤組織學分級相結合），RiskScore（紅色）和NomoScore（黑色）的ROC曲線
 
結論
本研究分析了患者樣本中的RRBS數據以篩選原始候選CpG位點，然后利用TCGA-KIRC數據訓練和驗證了18個CpG位點模型，并結合臨床特征建立了用于ccRCC預后或風險評估的列線圖模型。
基于該結果，研究開發并驗證了這種新型預后模型是一種實用、可靠的ccRCC患者預后工具。本研究結果支持異常DNAm變化與腫瘤發生密切相關的觀點，并為ccRCC提供了潛在的新型預后生物標志物，對更好的風險分層和個性化治療具有重要意義。

參考文獻：
Deng Q, Du Y, Wang Z, Chen Y, Wang J, Liang H, Zhang D. Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma. BMC Genomics. 2023 Jun 7;24(1):307.