表皮是一個多層組織，在保護機體免受水分流失、外來生物、紫外線和有害病原體的侵害方面起著至關重要的作用，特別是表皮的最外層——角質層（SC），提供了一個滲透性屏障，防止水分和電解質的流失，這種屏障功能的基本介質包括神經酰胺、膽固醇和長鏈脂肪酸類代謝物，它們的改變有可能導致人類皮膚疾病，包括牛皮癬和特應性皮炎。人鋅指(C2H2型)蛋白ZNF750是一種參與終表皮分化和癌癥的轉錄因子，此前有研究證實ZNF750基因的移碼突變可引起脂溢性皮炎。

2023年4月，意大利羅馬第二大學的研究團隊、賈偉教授等多個團隊共同在Science Advances (IF=14.957)期刊發表題為“ZFP750 affects the cutaneous barrier throughregulating lipid metabolism”的研究論文，揭示了ZFP750作為皮膚發育的關鍵轉錄因子，直接和/或間接調節神經酰胺生物合成關鍵酶的表達，對皮膚屏障通透性至關重要，這將有助于了解幾種人類皮膚病的發病機制。（賈偉教授作為本文共同作者之一，且本研究中脂質組檢測分析由麥特繪譜協助完成）

1. 轉錄因子ZFP750在體內的作用

如圖1 所示，構建基因敲除（KO）小鼠模型，導致Zfp750 mRNA有效降低。出生后，Zfp750−/−小鼠的皮膚有光澤、皺紋和粘性，眼睛已經睜開。妊娠第16.5天（E16.5），眼瞼明顯缺失。此外，與對照組相比，Zfp750−/−小鼠的體重有所減輕，并在20小時內死亡。而雜合小鼠Zfp750+/−未表現明顯的表型，與WT小鼠相似。皮膚屏障功能分析顯示，與對照組相比，Zfp750−/−小鼠的表皮厚度減少，角質層（SC）緊密壓實，出生后9小時內體重下降了15%。體重減輕是由于皮膚滲透性屏障功能受損導致的脫水，通過使用甲苯胺藍排除法評估了由外到內的滲透性屏障，皮膚屏障功能的改變也由內到外緊密連接屏障試驗證實。這些結果表明，Zfp750−/−小鼠在出生后不久死亡，并顯示出“由外向內”和“由內向外”皮膚屏障功能的嚴重改變，從而導致脫水，表明ZFP750在皮膚滲透性屏障中起著至關重要的作用。

圖1. Zfp750−/−小鼠皮膚屏障功能的改變

2. Zfp750−/−小鼠皮膚發育受損

在人角質形成細胞中，ZNF750既是祖基因的抑制因子，也是分化基因的激活因子。研究人員評估ZNF750在發育中的作用，分析了其缺失對角質形成細胞增殖的影響，以及對基底層(Krt14陽性細胞)向棘層(Krt10陽性細胞)轉移的影響。分析發現在Zfp750−/−小鼠的表皮中，觀察到幾個細胞Krt14和Krt10都呈陽性，這表明ZFP750的缺失延遲/損害了早期分化階段的角蛋白開關，Krt14 mRNA表達的增加也說明了這一點，并使小鼠表皮的增殖率顯著增加。進一步分析表明p63和ZFP750在表皮發育過程中協同作用，涉及p63-ZFP750和KLF4的調控軸在小鼠皮膚發育中并不完全保守。

ZNF750也參與控制表皮晚期分化基因的表達。隨后分析屏障缺陷與角化包膜蛋白成分的表達改變的關系，發現與WT小鼠相比，Zfp750−/−新生小鼠中受ZNF750調控的絲聚蛋白和兜甲蛋白（loricrin）表達下調，同時內披蛋白（IVL）上調。這可能是由于組織試圖恢復屏障功能。

3. Zfp750−/−小鼠脂質屏障組成改變

通過免疫熒光分析定位神經酰胺（Cer）和葡萄糖神經酰胺(GlcCer)，發現對照組小鼠中GlcCer/Cer主要定位于SC層和顆粒層，而在Zfp750−/−小鼠皮膚SC中完全不存在。

尼羅紅染料分析SC的脂質組成，在從對照小鼠分離的SC中有極性和非極性脂質的存在（明亮的金黃色）；相比之下，在Zfp750−/−小鼠的SC中，這兩種脂質的存在都明顯減少，這種減少對于非極性脂質(Cer，綠色熒光)更為明顯。分化3天后，來自Zfp750−/−小鼠的角質細胞也證實了非極性脂質的減少。

此外，WT小鼠的脂質呈織狀分布，而Zfp750−/−小鼠的SC中的脂質呈珍珠狀分布，透射電鏡分析也證實了SC中脂肪的點狀分布。WT小鼠超微結構分析顯示，顆粒層與SC之間的界面充滿片狀體(LBs)，呈橢圓形囊泡；相比之下，Zfp750−/−小鼠的界面幾乎沒有LBs。Zfp750−/−小鼠表皮中的酶原和酶活性形式均顯著減少，進一步證實Zfp750−/−小鼠中LBs的減少。

這些結果表明，ZFP750的缺失會改變表皮脂質組成，從而導致皮膚通透性屏障功能障礙。

圖2. Zfp750−/−表皮脂質組成異常

4. ZFP750調節角質化包膜相關蛋白和脂質成分的基因表達

小鼠表皮總RNA測序分析顯示，ZFP750基因缺失導致1722個基因表達改變，負責角化、細胞遷移和增殖過程的978個基因被上調，特別是參與角化過程的基因Krt2、Krt6b、Sprr1b、Sprr2d等，這可能是由于ZFP750缺失后分化程序的失調。此外，缺失ZFP750還導致編碼膽固醇酯（CE）晚期分化標記和前體的幾個基因下調，包括Lce1i、Lce1h、Lce1l和Lce1m。相反，Zfp750−/−表皮中有744個基因下調，基因本體（GO）分析顯示脂質代謝和角質細胞分化相關通路富集。其中55個參與脂質代謝的基因(Degs1、Degs2、Sgpl1、Elovl6、Elovl7和Kdsr)的表達在Zfp750−/−小鼠皮膚中被抑制。這些結果表明，轉錄因子ZFP750通過控制參與角化細胞包膜蛋白和脂質成分組裝的基因表達來調節表皮發育。

圖3. Zfp750基因缺失會導致參與脂質代謝、角質細胞分化和角質形成的基因失調

5. ZFP750是表皮神經酰胺代謝的關鍵調節因子

表皮神經酰胺及其相應的代謝物在皮膚屏障完整性的形成和維持中起著至關重要的作用。含有極長鏈(VLC)和超長鏈(ULC) FAs的神經酰胺的從頭合成始于表皮自旋/顆粒層的內質網(ER)，第一步是絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)使棕櫚酰輔酶A和L-絲氨酸縮合；這些生物合成途徑是在Zfp750−/−小鼠表皮中特有的。Sptlc1亞基和3-酮二氫鞘氨醇還原酶(Kdsr)的表達顯著降低，并且分別催化二羥基神經酰胺和神經酰胺生成的神經酰胺合成酶(CerS)和去飽和酶(Degs)的表達因缺失ZFP750而失調。

神經酰胺的FA成分VLC和ULC FAs是在角質形成細胞的內質網中合成的，它們的合成由7個酶組成的家族介導，稱為VLC FAs延伸1至7 (Elovl1至Elovl7)，該家族催化了構成長鏈FA延伸循環的四個反應中的第一個反應和限速反應。觀察到在WT組動物角化細胞分化過程中Elovl6的表達增加，Zfp750−/−小鼠中Elovl7的表達部分降低。另一方面，二酰基甘油酰基轉移酶（Dgat2）和中性鞘磷脂酶(Smpd3)在Zfp750−/−角化細胞分化過程中的表達上調被抵消。這些結果表明ZFP750是控制脂質角化包膜形成過程中關鍵酶表達的轉錄因子。

圖4. ZFP750控制神經酰胺生物合成相關基因的表達

6. Zfp750−/−小鼠表皮脂質成分失調

進一步驗證，對小鼠表皮進行脂質組學分析，結果顯示，在皮膚屏障通透性中起關鍵作用的神經酰胺類的數量嚴重失調，特別是飽和神經酰胺(d18:0/16:0)、(d18:1/16:0)、(d18:0/24:0)、(d18:0/26:0)均有顯著的積累。相反，在Zfp750−/−小鼠表皮中，C24-26單不飽和神經酰胺顯著減少，如(d18:1/24:0)、(d18:1/25:0)、(d18:1/26:0)和(d18:1/26:1)。這種變化可能是神經酰胺生物合成中涉及的關鍵酶的mRNA水平降低的結果。在哺乳動物細胞中，大多數神經酰胺也通過鞘磷脂合成酶轉化為鞘磷脂。由于幾種神經酰胺種類的數量減少，還觀察到突變小鼠表皮鞘磷脂的顯著減少。

表皮中性脂質代謝在維持皮膚適當的滲透性屏障方面也起著關鍵作用。分析顯示，從Zfp750−/−小鼠表皮中甘油三酯(TAG)的數量顯著減少，這與突變小鼠表皮中幾種1,2-二酰基甘油的顯著增加有關。

膽固醇是表皮的重要組成部分，膽固醇酯（CE）的極性比游離膽固醇低，可以增強皮膚的疏水性，促進屏障功能。特別是新生小鼠的表皮主要含有CE和C16-18 FA。突變小鼠表皮的膽固醇酯(C16-18)水平顯著降低。

LB中所含的磷脂在角質層SC中代謝為游離FAs，這反過來又有助于SC的酸化。研究表明，ZFP750是磷脂的適當生物合成所必需的。具體來說，Zfp750−/−小鼠表皮中磷脂，即磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇的含量明顯失調，包括醚鍵在內的幾種磷脂酰絲氨酸在Zfp750−/−小鼠表皮中有明顯的積累，同時發現少數磷脂酰肌醇減少。

因此，脂質組學分析證實了關鍵角化細胞特異性脂質的減少，證明了ZFP750在表皮中允許合成適當脂質屏障方面的相關性。

最后，研究人員通過小干擾RNA (siRNA)抑制ZNF750在人角質形成細胞中的表達評估ZNF750對表皮脂質代謝的調節是否在人類中也保守，分析顯示Degs1、Degs2、Dgat2、Smpd3、Elovl6和Elovl7 mRNA水平顯著降低，它們的失調與非極性脂質水平顯著降低有關。ZNF750直接和/或間接調控表皮脂質合成關鍵酶的表達。

圖5. Zfp750基因缺失導致表皮脂質組成受損

小結

綜上，本研究確定了人鋅指(C2H2型)蛋白ZFP750是表皮屏障功能的主要調節劑，通過控制參與幾種表皮脂質合成酶的表達來控制表皮脂質組成，這將有助于了解幾種人類皮膚病的發病機制。

圖6. ZFP750作為表皮脂質生物合成的主要調節因子

原文信息

Butera A, et al. ZFP750 affects the cutaneous barrier through regulating lipid metabolism. Sci Adv. 2023.

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