1. 什么是雙特異性納米抗體

雙特異性抗體（Bispecificantibody，BsAb）是1960年Nisonoff 團隊首次提出，是一種可以同時結合兩種特異性表位或目的物的人工工程化抗體。2009年首個BsAb藥物Catumaxomab被歐盟批準上市，給腫瘤治療帶來了新的希望。
雙特異性納米抗體是指利用基因工程技術對納米抗體進行人工改造，形成新的雙特異性納米抗體分子，并保持其優異的性能，從而在抗體工程應用領域具有良好的前景。

圖1：雙特異性納米抗體

2. 納米抗體及優點

羊駝是駱駝科的成員，包括美洲駝（Llama）以及我們熟悉的羊駝（Alpaca）。除常規IgG外，駝科動物還產生一種功能性單鏈抗體，該抗體能夠與抗原結合，即為納米抗體，有時稱為VHH抗體。納米抗體（Nanobody, Nb 晶體為2.5nm，長4nm，分子量只有15KDa。這些抗體僅由重鏈組成，缺乏輕鏈和功能性CH1和CH4結構域。這些所謂的重鏈抗體正被用于開發單域抗體。這些抗體的單結構域性質提供了獨特的優勢，使其在生物技術應用中脫穎而出。

納米抗體的優點：

（1）在高溫和pH下的穩定性；
（2）VHH可以識別通常不被常規抗體識別的抗原位點；
（3）它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標記應用，包括跨越血腦屏障；
（4）用于大規模生產節約成本的替代品。

3. 納米抗體的制備

相比較傳統的單克隆抗體，納米抗體的制備具有很大優勢。可以概括為免疫羊駝獲得抗體基因和噬菌體展示來獲得目的抗體序列。主要分為羊駝免疫，噬菌體文庫構建，篩選抗體庫、抗體表達與功能驗證四個步驟。

3.1羊駝免疫

挑選適齡羊駝→準備抗原→免疫羊駝→采血測定效價→PBMC細胞分離

3.2 噬菌體文庫構建

RNA提取→cDNA反轉錄合成→PCR擴增→連接載體并電轉化→細菌文庫/噬菌體文庫建立

3.3 抗體庫篩選

常規使用的篩選方法是固相篩選，磁珠和細胞篩選，卡梅德生物可以根據客戶需求提供定制化的篩選體系。

3.4 抗體表達與功能驗證

構建哺乳表達載體進行表達→過鎳柱純化→親和力測定

圖2：Fc-VHH納米抗體表達結果圖片

4. 雙特異性納米抗體的制備

雙特異性抗體制備的方法目前主要有化學偶聯法、雙雜交瘤融合法、重組基因法。
（1）化學偶聯法：原理是通過化學偶聯劑（如鄰苯二馬來酰亞胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸鹽、二硫代酰基苯甲酸等）將兩個完整IgG或兩個F(ab)2抗體片段偶聯成一種BsAb，優點是方法操作簡單，速度快，缺點是容易致癌。
（2）雙雜交瘤融合法：利用細胞融合技術制備雜交瘤細胞系，然后對特定的抗體進行分離。雜交瘤細胞系制備會讓重鏈-輕鏈抗體隨機結合，因此制備的雙特異性抗體具有隨機性，效率比較低。
（3）重組基因法：這種方法可以解決雙雜交瘤融合法重鏈-輕鏈抗體隨機結合的問題，是目前最普遍使用的方法。

5. 雙特異性納米抗體構建

 由于納米抗體只有一個重鏈可變區，雙特異性納米抗體的設計避免了雙抗體制備過程中重鏈與輕鏈的錯配，從而實現了通用設計，開發了多種設計雙特異性抗體的方法。
（1）VHH可組裝成雙特異性抗體，用于提高抗原結合的特異性，減少脫靶效應，用于同一抗原的不同表位，雙特異性抗體可與不同抗原的納米抗體組合在一起。
（2）為了制備多特異性納米抗體，雙特異性納米抗體可與其它多肽或蛋白質結合。
（3）FC片段也可用于將VHH與SCFV片段偶聯產生雙抗，可以增強ADCC或ADCP效應。雙特異性納米抗體可以作為CAR-T療法中的工具。CAR-T療法是一種新型的精準靶向治療腫瘤的療法，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法。利用基因工程技術，將激活的T細胞安裝在定位導航裝置CAR(腫瘤嵌合抗原受體)上，將T細胞打造成“超級戰士”CAR，能準確、專門地識別和消除體內的腫瘤細胞。 

圖3：納米抗體改造

6. 雙特異性藥物發展現狀

目前已有3款雙特異性抗體藥物成功上市，先后順序是Catumaxomab（卡妥索單抗）2009年上市，用于惡性腹腔積液的治療；Blinatumomab（博納吐單抗）2014年上市，用于急性淋巴細胞白血病的治療；Emicizumab2017年上市，用于A型血友病的治療。雙特異性抗體藥物極具市場前景，目前諸多跨國藥企如羅氏、輝瑞等紛紛推出相關抗體藥物，相信不久的未來，科技不斷發展會研發出更多抗體藥物，為患者帶去希望。