背景：近年來(lái)，人們對(duì)外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（ev）所攜帶的RNA和其他分子的重要性越來(lái)越感興趣。因?yàn)樵诤芏鄳?yīng)用中，尤其是在外泌體作為診斷性生物標(biāo)志物和治療性載體的臨床應(yīng)用已經(jīng)在逐漸發(fā)揮作用。關(guān)于外泌體的純化及應(yīng)用，小優(yōu)之前就做過(guò)專題的系列軟文及講座，劃到最底端可以回顧哦~
 

即使外泌體純化的方法多種多樣，但不同的樣本以及不同的應(yīng)用情況下，大家在選擇純化方式時(shí)，依然會(huì)有選擇恐懼癥。今天小優(yōu)帶大家針對(duì)外泌體內(nèi)RNA分子研究的整套流程，進(jìn)行一個(gè)梳理，有幫助的情況下請(qǐng)“一鍵三連”哦~

Tip1：對(duì)于從EVs中特異性分析RNA，必須通過(guò)過(guò)濾或離心去除殘留的細(xì)胞、細(xì)胞片段和凋亡小體。否則，殘留的細(xì)胞RNA數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)游離RNA，對(duì)分析造成巨大的難度，即使是少量的細(xì)胞碎片也可以對(duì)無(wú)細(xì)胞液體的RNA譜產(chǎn)生非常顯著的影響。

（1）在獲取血清血漿樣本時(shí)，首先進(jìn)行低速離心去除血細(xì)胞。采血后越早去除細(xì)胞材料，在體外產(chǎn)生的血細(xì)胞來(lái)源的囊泡的額外背景的風(fēng)險(xiǎn)就越低。

（2）對(duì)于所有其他生物液體（包含細(xì)胞上清），必須進(jìn)行高重力離心步驟或過(guò)濾，以去除所有剩余的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、凋亡小體等。這會(huì)顯著減少細(xì)胞或基因組DNA和RNA的含量。

推薦使用0.8 μm過(guò)濾器孔徑（或3000xg離心）將有效地排除細(xì)胞物質(zhì)，包括血小板碎片，但仍保留絕大多數(shù)EVs，而使用0.2或0.45 μm過(guò)濾器（或離心，例如16000xg）將去除一些較大的囊泡。

Tip2：針對(duì)尿液等樣本，富含干擾成分，可進(jìn)行長(zhǎng)短RNA的分離；并建議使用晨尿樣本

尿液中可能含有各種代謝物，它們可能會(huì)干擾RNA分析，例如，使用RT-PCR或RNA-Seq。為了確保分離的RNA的最佳性能，我們建議分別分離長(zhǎng)RNA和短RNA物種（分別大于或小于約200nt）。對(duì)于短RNA的分離，使用Reagent UI（cat:77900，QIAGEN）。

Tip3：膜親和法純化EVs，其整體表達(dá)譜更完整，且操作簡(jiǎn)單，便于下游RNA的一步分離

QIAGEN exoEasy 系列試劑盒使用基于膜的親和結(jié)合步驟從無(wú)細(xì)胞生物液體中分離出外泌體和其他ev。該方法不根據(jù)大小或細(xì)胞來(lái)源來(lái)區(qū)分ev，也不依賴于特定表位的存在。而是利用囊泡的一般生化特征來(lái)進(jìn)行外泌體的純化，下游可進(jìn)行粒徑分析、WB、電鏡、及RNA分析等。初次之外，升級(jí)的exoRNeasy系列可直接進(jìn)行樣本中外泌體RNA的純化，減少移液步驟，得率更高。1h內(nèi)即可完成純化哦~

圖注：The exoRNeasy Midi/Maxi Kit 純化外泌體和總RNA分離在不到1小時(shí)內(nèi)

Tip 4：miRNA純化后定量，使用qRT-PCR結(jié)果更精準(zhǔn)

常規(guī)的RNA濃度使用分光光度計(jì)測(cè)量260 nm（A260）處的吸光度來(lái)確定。然而，對(duì)于從EVs中獲得的少量RNA，可能很難用光度法確定其數(shù)量。少量的RNA可以使用安捷倫®2100生物分析儀、定量RT-PCR或熒光定量法進(jìn)行定量。當(dāng)從特別小的樣本（如激光顯微解剖樣本，或血漿或血清）中純化RNA時(shí)，應(yīng)使用qRT-PCR進(jìn)行定量。RIN值通常也不能作為EVs（或總血漿或血清）中細(xì)胞游離RNA的RNA完整性的指標(biāo)。

Tip 5：EVs（或總血漿或血清）中，內(nèi)參需謹(jǐn)慎選擇，或使用外參作為對(duì)照

在進(jìn)行細(xì)胞、血液、組織microRNA檢測(cè)時(shí)，我們常用選擇U6做內(nèi)參基因。不過(guò)在EVs中miRNA的內(nèi)參，大家各有己見。除各自摸索的內(nèi)參外，選擇添加外參也是一種常見的形式，其中cel-miR-39-3p被最廣泛的應(yīng)用，將此RNA加入到樣本中，進(jìn)行共同純化，可以檢測(cè)提取、PCR等過(guò)程。
RNA Spike-In Kit, For RT（cat:339390，QIAGEN）是最新推出的一個(gè)參照試劑盒，其中包含兩個(gè)部分：Box1：提前預(yù)混的UniSp2、 UniSp4 和 UniSp5，主要用于RNA純化的對(duì)照。Box2：cel-miR-39-3p，用于cDNA合成對(duì)照。以上試劑盒兼容SYBR GREEN和probe方法的qPCR。