全基因組DNA甲基化分析揭示DNMT1在斑馬魚模型聽覺系統發育中的作用
聽力障礙通常與內耳發育不全或損傷有關，是影響生活質量的嚴重健康問題。因此研究聽覺器官發生過程中的關鍵基因對于探索聽力損傷的潛在策略至關重要。斑馬魚模型在理解內耳發育不良和相關疾病的分子遺傳學原理方面得到了越來越多的應用，內耳發育包括遺傳遺傳機制和表觀遺傳機制。
2022年03月29日，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院何英姿團隊和皖南醫學院弋磯山醫院劉少峰團隊合作在《Cell Prolif》雜志發表題為“Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling”的研究論文，該研究以斑馬魚為實驗模型，通過RNA測序（RNA-seq）、原位雜交（ISH）、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和免疫組化等方法揭示了DNMT1（DNA methyltransferase 1 ，DNA甲基轉移酶1）在聽覺系統發育中的重要作用。
標題：Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling Dnmt1通過細胞周期阻滯和Fgf信號調控聽覺器官發育
時間：2022-03-29
期刊：Cell Proliferation
影響因子：IF 8.755
技術平臺：WGBS、RNA-seq、ISH 等
研究摘要
本研究以斑馬魚為實驗模型，探討DNA甲基轉移酶1 (DNMT1)在聽覺系統發育中的作用。用嗎啉寡核苷酸(mololino oligonucleotide)誘導Dnmt1缺失，利用RNA-seq、ISH、WGBS和免疫組化等方法研究其形態學改變和機制。結果表明，在斑馬魚發育中的后側線（posterior lateral line，pLL）系統中，Dnmt1下調誘導神經丘（neuromasts）數量減少，并抑制原基細胞增殖。ISH結果表明，Fgf信號通路被抑制，趨化因子成員cxcr4b、cxcr7b和cxcl12a表達受到干擾，而lef1表達在抑制Dnmt1后增加。此外，Dnmt1表達下調導致耳石畸形和半規管畸形，胞囊（utricle）和球囊（saccule）的毛細胞（hair cell，HC）分化受到嚴重抑制。當Dnmt1表達下調時，耳基板標志物pax2/5和fgf3/8/10的原位染色減少。WGBS分析表明全基因組甲基化水平顯著下調，其中細胞周期基因在Dnmt1實驗組和對照組之間的表達差異最大。進一步的ISH分析證實了RNA-seq和WGBS實驗結果，cdkn1a和tp53在Dnmt1敲除后均上調。本研究結果表明，Dnmt1通過調控細胞周期基因以及Wnt和Fgf信號通路對斑馬魚聽覺器官的發育至關重要。
研究方法：
（1）全胚原位雜交(whole mount In situ hybridization, WISH)技術檢測了Dnmt1在斑馬魚胚胎早期發育過程中的時空特異性表達模式。Dnmt1在眼、內耳和側線系統中的強表達模式表明，Dnmt1在這些器官的發育和分化中至關重要。
（2）通過斑馬魚的胚胎顯微注射Morpholinos方法下調Dnmt1表達，結果表明與對照組相比，Dnmt1- MO胚胎表現出一定程度的發育遲緩和畸形，包括耳石器官異常、半規管畸形和側線系統神經丘數量減少。
（3）通過ISH、 RNA-seq和WGBS分析結果表明，Dnmt1通過調控耳囊泡(OV)特異性基因、FGF信號通路和細胞周期信號通路來調控斑馬魚聽覺器官的發育。
結果圖形
（1）Dnmt1在斑馬魚內耳和神經丘中的表達
（2）Dnmt1為側線神經丘（lateral line neuromasts）沉積所必需
G-H：Dnmt1 morpholino注射后，Dnmt1的蛋白印跡在條帶強度（G）和定量分析（H）中均顯著降低。
D-E. 與對照組（D）相比，Dnmt1突變體（E）在側線神經丘的eya1染色中發現神經丘數量減少和神經丘之間的距離延長。
G-H. 轉基因斑馬魚系cldnb:lynGFP證實了在WISH中觀察到的結果。
C、F、I. 在mRNA組和MO聯合注射組中成功挽救了形態學、eya1染色和綠色熒光標記的神經丘。
（3）抑制Dnmt1表達可顯著抑制PLL細胞增殖
圖4： Dnmt1下調在原基遷移和神經丘形成過程中抑制細胞增殖。
A-L. 對照胚胎和Dnmt1缺失突變體之間BrdU標記的增殖細胞數量比較代表性圖像
M-N. 對照組胚胎(n=32)和Dnmt1-MO胚胎(n=31)的BrdU指數差異有統計學意義
（4）DNMT1通過調節Fgf、Wnt和趨化因子信號通路調控PLL發育
（5）斑馬魚Dnmt1基因敲除導致嚴重的耳畸形
圖6：敲除Dnmt1會破壞半規管和耳石器官的正常發育
（6）Dnmt1通過調控pax家族和Fgf信號通路參與斑馬魚內耳胚胎發生
（7）Dnmt1在斑馬魚發育過程中調控cdkn1a和tp53的轉錄水平
圖9：RNA-seq分析揭示細胞周期基因是斑馬魚耳發育過程中Dnmt1抑制的關鍵調控因子。
B-C. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組中低甲基化（B）和高甲基化（C）的DMR數量。橫坐標表示不同的甲基化水平。
D. Circos圖顯示與Con-MO組相比，基因組Dnmt1-MO組中DEG和DMR的總體分布。從外圈到內圈分別表示染色體數目、DEG（RNA-Seq）和DMR（CpG）。紅色表示上調，藍色表示下調；顏色越深，差異越大。
E. 熱圖顯示與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組共有的DEG和DMR相關基因。紅色表示上調，綠色表示下調。
F-G. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO突變體功能區中tp53和cdkn1a的甲基化水平均顯著降低。TES轉錄終止位點；TSS轉錄起始位點。
參考文獻：
Tang D, Zheng S, Zheng Z, Liu C, Zhang J, Yan R, Wu C, Zuo N, Wu L, Xu H, Liu S, He Y. Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling. Cell Prolif. 2022 May;55(5):e13225.
2022年03月29日，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院何英姿團隊和皖南醫學院弋磯山醫院劉少峰團隊合作在《Cell Prolif》雜志發表題為“Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling”的研究論文，該研究以斑馬魚為實驗模型，通過RNA測序（RNA-seq）、原位雜交（ISH）、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和免疫組化等方法揭示了DNMT1（DNA methyltransferase 1 ，DNA甲基轉移酶1）在聽覺系統發育中的重要作用。
時間：2022-03-29
期刊：Cell Proliferation
影響因子：IF 8.755
技術平臺：WGBS、RNA-seq、ISH 等
研究摘要
本研究以斑馬魚為實驗模型，探討DNA甲基轉移酶1 (DNMT1)在聽覺系統發育中的作用。用嗎啉寡核苷酸(mololino oligonucleotide)誘導Dnmt1缺失，利用RNA-seq、ISH、WGBS和免疫組化等方法研究其形態學改變和機制。結果表明，在斑馬魚發育中的后側線（posterior lateral line，pLL）系統中，Dnmt1下調誘導神經丘（neuromasts）數量減少，并抑制原基細胞增殖。ISH結果表明，Fgf信號通路被抑制，趨化因子成員cxcr4b、cxcr7b和cxcl12a表達受到干擾，而lef1表達在抑制Dnmt1后增加。此外，Dnmt1表達下調導致耳石畸形和半規管畸形，胞囊（utricle）和球囊（saccule）的毛細胞（hair cell，HC）分化受到嚴重抑制。當Dnmt1表達下調時，耳基板標志物pax2/5和fgf3/8/10的原位染色減少。WGBS分析表明全基因組甲基化水平顯著下調，其中細胞周期基因在Dnmt1實驗組和對照組之間的表達差異最大。進一步的ISH分析證實了RNA-seq和WGBS實驗結果，cdkn1a和tp53在Dnmt1敲除后均上調。本研究結果表明，Dnmt1通過調控細胞周期基因以及Wnt和Fgf信號通路對斑馬魚聽覺器官的發育至關重要。
研究方法：
（1）全胚原位雜交(whole mount In situ hybridization, WISH)技術檢測了Dnmt1在斑馬魚胚胎早期發育過程中的時空特異性表達模式。Dnmt1在眼、內耳和側線系統中的強表達模式表明，Dnmt1在這些器官的發育和分化中至關重要。
（2）通過斑馬魚的胚胎顯微注射Morpholinos方法下調Dnmt1表達，結果表明與對照組相比，Dnmt1- MO胚胎表現出一定程度的發育遲緩和畸形，包括耳石器官異常、半規管畸形和側線系統神經丘數量減少。
（3）通過ISH、 RNA-seq和WGBS分析結果表明，Dnmt1通過調控耳囊泡(OV)特異性基因、FGF信號通路和細胞周期信號通路來調控斑馬魚聽覺器官的發育。
結果圖形
（1）Dnmt1在斑馬魚內耳和神經丘中的表達
圖1：Dnmt1為斑馬魚內耳和pLL發育所必需。
WISH染色描繪了Dnmt1在2-cell期（two-cell stage）（a）、oblong期（B）、胚盾期(shield stage)（C）、體節期(segmentation period)（D:側視圖，E:背視圖，F:12hpf時的腹視圖，G:20hpf時d 側視圖）的持續表達。Dnmt1高表達水平富集在26-48hpf的遷移原基（H和I）、頭部區域的內耳和后側線（J）的沉積神經丘上。原基（primordium）（I1）、內耳（inner ear）（J1）和神經丘（neuromast）（J2）結構的放大倍數圖像表明Dnmt1高表達。（2）Dnmt1為側線神經丘（lateral line neuromasts）沉積所必需
圖2：敲除Dnmt1后，Dnmt1表達顯著下調。
A-F：與對照組相比，Dnmt1-MO胚胎中Dnmt1原位染色在不同時期WISH均下調。黑色虛線分別表示48 hpf時的耳囊泡（A,C）和神經丘（B,D）。E-F中的黑色虛線表示32 hpf時的原基。G-H：Dnmt1 morpholino注射后，Dnmt1的蛋白印跡在條帶強度（G）和定量分析（H）中均顯著降低。
圖3：Dnmt1是斑馬魚后側線神經丘沉積所必需的。
A-B. 48 hpf時，野生型胚胎和Dnmt1缺失型胚胎的大體形態。D-E. 與對照組（D）相比，Dnmt1突變體（E）在側線神經丘的eya1染色中發現神經丘數量減少和神經丘之間的距離延長。
G-H. 轉基因斑馬魚系cldnb:lynGFP證實了在WISH中觀察到的結果。
C、F、I. 在mRNA組和MO聯合注射組中成功挽救了形態學、eya1染色和綠色熒光標記的神經丘。
（3）抑制Dnmt1表達可顯著抑制PLL細胞增殖
圖4： Dnmt1下調在原基遷移和神經丘形成過程中抑制細胞增殖。
M-N. 對照組胚胎(n=32)和Dnmt1-MO胚胎(n=31)的BrdU指數差異有統計學意義
（4）DNMT1通過調節Fgf、Wnt和趨化因子信號通路調控PLL發育
圖5：Dnmt1缺失抑制斑馬魚原基中的Fgf信號和趨化因子超家族。
（5）斑馬魚Dnmt1基因敲除導致嚴重的耳畸形
圖6：敲除Dnmt1會破壞半規管和耳石器官的正常發育
圖7：Dnmt1抑制影響HC在胞囊和球囊中的分化。
（6）Dnmt1通過調控pax家族和Fgf信號通路參與斑馬魚內耳胚胎發生
圖8：Dnmt1敲除后耳板編碼標記基因表達變化
（7）Dnmt1在斑馬魚發育過程中調控cdkn1a和tp53的轉錄水平
圖9：RNA-seq分析揭示細胞周期基因是斑馬魚耳發育過程中Dnmt1抑制的關鍵調控因子。
- 火山圖分析顯示了這兩組的所有DEG。
- Venn圖進一步標記了Con-MO和Dnmt1-MO組中唯一和重疊DEG數量。
- KEGG富集分析顯示，Dnmt1敲除樣品和對照組之間的前20個信號通路存在統計學差異。
- 兩組的細胞周期通路DEG聚類分析。
- ISH數據證實，與對照組相比，48 hpf時敲除Dnmt1后cdkn1a（p21）和tp53均上調
圖10：WGBS分析檢測Dnmt1敲除后的全基因組低甲基化。
A. 小提琴圖顯示具有三個生物學重復的Con-MO組和Dnmt1-MO組的整體甲基化水平。白點表示中值，黑色實框表示四分位距（interquartile range, IQR），細黑線表示數據范圍，小提琴的寬度表示分布密度。B-C. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組中低甲基化（B）和高甲基化（C）的DMR數量。橫坐標表示不同的甲基化水平。
D. Circos圖顯示與Con-MO組相比，基因組Dnmt1-MO組中DEG和DMR的總體分布。從外圈到內圈分別表示染色體數目、DEG（RNA-Seq）和DMR（CpG）。紅色表示上調，藍色表示下調；顏色越深，差異越大。
E. 熱圖顯示與Con-MO組相比，Dnmt1-MO組共有的DEG和DMR相關基因。紅色表示上調，綠色表示下調。
F-G. 與Con-MO組相比，Dnmt1-MO突變體功能區中tp53和cdkn1a的甲基化水平均顯著降低。TES轉錄終止位點；TSS轉錄起始位點。
參考文獻：
Tang D, Zheng S, Zheng Z, Liu C, Zhang J, Yan R, Wu C, Zuo N, Wu L, Xu H, Liu S, He Y. Dnmt1 is required for the development of auditory organs via cell cycle arrest and Fgf signalling. Cell Prolif. 2022 May;55(5):e13225.
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