Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒概述
 
Cell Meter  PE-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產的用于檢測細胞凋亡的試劑盒，膜聯蛋白V可以與包括PE的熒光染料結合。該染料保留了其對磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，因此可用作流式細胞術分析正在經歷細胞凋亡的細胞的敏感探針。由于PS的外化發生在細胞凋亡的早期階段，PE膜聯蛋白V染色可以比基于核變化（例如DNA片段化）的測定更早地鑒定細胞凋亡。 PE膜聯蛋白V染色先于膜完整性的喪失，膜完整性伴隨由凋亡或壞死過程導致的最新細胞死亡階段。因此，用PE膜聯蛋白V染色通常與碘化丙啶（PI）或7-氨基 - 放線菌素（7-AAD）等活體染料結合使用，使研究者能夠鑒別早期凋亡細胞（7-AAD陰性，PE膜聯蛋白V陽性）。具有完整膜的存活細胞排除7-AAD，而死亡和受損細胞的膜可透過7-AAD。例如，被認為存活的細胞既是PE膜聯蛋白V也是7-AAD陰性的，而處于早期凋亡的細胞是PE膜聯蛋白V陽性和7-AAD陰性，而處于晚期凋亡或已經死亡的細胞都是PE膜聯蛋白V和7-AAD陽性。該測定法不區分經歷凋亡性死亡的細胞與因壞死性通路而死亡的細胞，因為在任一情況下，死亡細胞都將用PE膜聯蛋白V和7-AAD染色。然而，當隨著時間測量細胞凋亡時，可以經常從PE膜聯蛋白V和7-AAD陰性（可行的，或不可測量的細胞凋亡）追蹤細胞至PE膜聯蛋白V陽性和7-AAD陰性（早期凋亡，膜完整性存在），最后是PE膜聯蛋白V和7-AAD陽性（末期凋亡和死亡）。細胞通過這三個階段的運動表明細胞凋亡。

Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒適用儀器  
流式細胞儀
E  x:       488nm or 561nm
E  m:       575/26nm
通道:       PE通道

Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒實驗方案  

簡要概述
（1）用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞
（2）添加RPE-膜聯蛋白V測定溶液
（3）在室溫下孵育20-60分鐘
（4）使用FL2通道（Ex / Em = 488/585 nm）用流式細胞儀分析細胞

儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復凍融循環。
RPE-Annexin V原液（100X）：
將含有0.2％BSA的200μLPBS加入到RPE-膜聯蛋白V（組分A）的小瓶中以制備100X RPE-膜聯蛋白V儲備溶液。 注意：將重構的100X RPE-Annexin V儲備溶液儲存在4°C。

操作步驟
A.用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。注意：膜粘附細胞的膜聯蛋白V流式細胞術分析未經常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法。
B.離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。
C.將細胞重懸于200μL測定緩沖液（組分B）中。
D.向細胞中加入2μL100XRPE-膜聯蛋白V原液。
E.可選：為壞死細胞添加2μL100XNuclear Red DCS（成分C）。
F在室溫下孵育20至60分鐘，避光。
G可選：在使用流式細胞儀分析細胞之前，添加200至300μL的測定緩沖液（組分B）以增加體積。
H.使用具有FL2通道的流式細胞儀（Ex / Em = 488 / 585nm）監測RPE-膜聯蛋白V的熒光強度。當將Nuclear Red DCS添加到細胞中時，使用FL4通道測量細胞活力。
4.百螢 Cell Meter PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒數據分析
在活的非凋亡細胞中，RPE-模聯蛋白V檢測非誘導細胞中的先天性細胞凋亡，其通常為所以細胞的2-6%。在凋亡細胞中，RPE-模聯蛋白V與磷脂酰絲氨酸結合，磷脂酰絲氨酸位于細胞膜的外葉上，因此導致染色強度增加。


圖1.使用Cell Meter RPE-膜聯蛋白V結合細胞凋亡檢測試劑盒檢測RPE-膜聯蛋白V對Jurkat細胞中磷脂酰絲氨酸的結合活性。 將Jurkat細胞在37℃，5％CO2培養箱中在沒有（藍色）或1μM星形孢菌素（紅色）的情況下處理4-5小時，然后用RPE-膜聯蛋白V染色30分鐘。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson）流式細胞儀使用FL2通道測量RPE-膜聯蛋白V的熒光強度。

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