牙周膜干細(xì)胞中機械力誘導(dǎo)的自噬通過AKT信號通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化
在牙齒移動過程中，牙周組織中形成無菌炎癥微環(huán)境，其特征在于炎癥細(xì)胞因子，趨化因子的表達(dá)升高和炎癥免疫細(xì)胞的激活增加。作為牙周組織中的主要間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）在牙齒移動過程中不斷接受機械力刺激，參與炎癥反應(yīng)和骨重建過程。
自噬已逐漸被認(rèn)為是在外部刺激（例如應(yīng)激，炎癥，缺氧和機械負(fù)荷）下維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)的重要保護(hù)性細(xì)胞過程。此外，自噬也可能適應(yīng)機械負(fù)荷，可以在成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和 PDLSC s等機械敏感細(xì)胞中被激活。然而，PDLSCs中的自噬是否影響機械力刺激下牙周組織的炎癥微環(huán)境需要進(jìn)一步探索。
在機械力誘導(dǎo)的炎癥骨重建過程中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是重要的免疫細(xì)胞之一。在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，其表現(xiàn)出獨特的表型和功能：經(jīng)典型巨噬細(xì)胞極化主要由M1型巨噬細(xì)胞構(gòu)成，表現(xiàn)出與炎癥和細(xì)胞毒性相關(guān)的功能，另一型巨噬細(xì)胞極化主要由M2型巨噬細(xì)胞構(gòu)成，與組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。研究已經(jīng)證實，M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動期間的骨重建和牙根吸收過程中至關(guān)重要。
鑒于M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動過程中的重要性，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科聯(lián)合團(tuán)隊的一項研究曾假設(shè)PDLSCs中的自噬在機械力刺激下影響巨噬細(xì)胞極化，從而影響牙槽骨重建，研究旨在驗證PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬是否以及如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，并有助于牙周炎微環(huán)境和牙齒移動過程中的骨重建。
PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬有助于體內(nèi)M1巨噬細(xì)胞極化
為了研究機械力是否可以激活自噬，建立了牙齒移動的實驗動物模型，并使用抑制劑3-MA阻斷自噬。機械力刺激7天后，牙齒移動距離增加，而注射3-MA可縮短此距離（圖1 A）。機械力刺激后，自噬蛋白LC3、促炎細(xì)胞因子TNF-α和MSC表面標(biāo)志物CD146在牙周組織受壓側(cè)的表達(dá)增加。同時，TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量也增加（圖1 B、C）。3-MA可顯著降低LC3、TNF-α和CD146的表達(dá)，以及TRAP+ 破骨細(xì)胞的數(shù)量。盡管如此，與對照組相比，機械力+3-MA組CD146 + MSCs 和TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量仍上調(diào)（圖1 B、C）。
為了評估力誘導(dǎo)自噬對體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化的影響，進(jìn)行了免疫熒光染色以鑒定力刺激后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的變化。受力刺激后牙周韌帶受壓側(cè) CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，3-MA注射后顯著減少。雖然機械力+3-MA處理后CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，但受力刺激后M1/M2巨噬細(xì)胞極化比顯著增加，3-MA注射后顯著降低（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明，自噬調(diào)節(jié)機械力刺激后的巨噬細(xì)胞的極化，并影響牙槽骨重建和牙齒移動過程。
機械力激活PDLSCs中的自噬
為了探索機械力下的自噬活性，在體外對PDLSCs進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光染色自噬通量測定和TEM。LC3是最重要的自噬相關(guān)蛋白之一。在12 小時的0.5-2.5 g/cm2的壓縮力負(fù)荷下，LC3II/I的表達(dá)增加。然而，1.0和1.5g/cm2的壓縮力觸發(fā)了LC3II/I 的zui強表達(dá)，隨后在實驗中使用 1.5g/cm2 壓縮力。
壓縮力刺激3 h后LC3II/I的表達(dá)量開始增加，并持續(xù)至24 h。此外，在壓縮力刺激2、6h后，另一種自噬標(biāo)志物P62/SQSTM（P62）的表達(dá)下降，而Beclin1的表達(dá)在力刺激3h后增加。實時熒光定量PCR顯示，與對照組相比，Beclin1的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。免疫熒光染色顯示，在壓縮力刺激12h后，PDLSCs中聚集的LC3陽性表達(dá)，在雷帕霉素應(yīng)用后進(jìn)一步增強。
用壓縮力刺激細(xì)胞12 h，用顯微鏡檢測自噬通量。結(jié)果表明，自噬溶酶體和自噬體的數(shù)量顯著較高。此外，壓縮力刺激后，TEM可在PDLSCs中發(fā)現(xiàn)明顯的自噬體。這些數(shù)據(jù)表明，在壓縮力刺激下，PDLSCs的自噬可以在壓縮力依賴性和時間依賴性趨勢中被激活。
力刺激的PDLSC自噬在體外誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化
為了進(jìn)一步檢測力刺激的PDLSCs中的自噬是否會影響巨噬細(xì)胞極化，使用來自機械力刺激的PDLSCs（FS）、機械力刺激的PDLSCs + 3-MA處理（FS + 3-MA）或自噬激活劑雷帕霉素（FS + Rapa）的上清液來處理THP-1來源的巨噬細(xì)胞，無力加載作為對照（CS）（圖2 A）。
FS組THP-1來源巨噬細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，在FS + 3-MA組下調(diào)，而FS + Rapa組進(jìn)一步上調(diào)。然而，未觀察到M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1的表達(dá)（圖2 B）。
免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，F(xiàn)S組CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞比例顯著增加，在FS + 3-MA組部分被阻斷，而FS + Rapa組增強。然而，CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞的比例沒有改變（圖2 C、D）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，F(xiàn)S組M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS的表達(dá)顯著增加，在FS + 3-MA組下調(diào)，而FS + Rapa組上調(diào)（圖2 E）。然而，M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1的表達(dá)沒有改變（圖2 E）。僅應(yīng)用3-MA或雷帕霉素不會改變THP-1巨噬細(xì)胞中TNF-α或精氨酸酶-1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，在機械力刺激的PDLSCs中，自噬可以在體外引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。
牙周膜干細(xì)胞自噬通過抑制AKT信號通路調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞極化
在驗證了PDLSC自噬與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系后，實驗最后探討了其潛在機制。AKT信號通路已被公認(rèn)為巨噬細(xì)胞存活和極化的關(guān)鍵介質(zhì)。作為巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 活性的增加引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。
實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將條件培養(yǎng)基應(yīng)用于THP-1來源的巨噬細(xì)胞中時，F(xiàn)S組中磷酸化-AKT的表達(dá)受到顯著抑制，而3-MA（FS + 3-MA）阻斷自噬會增加磷酸化-AKT的表達(dá)，雷帕霉素增強自噬逆轉(zhuǎn)了上述磷酸化-AKT水平的增加。相比之下，在機械力刺激的PDLSCs的上清液中孵育后，NF-κB / P65的表達(dá)上調(diào)，雷帕霉素進(jìn)一步增強。
為了進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控機制，將AKT信號激活劑IGF1和抑制劑GSK690693應(yīng)用于THP-1衍生的巨噬細(xì)胞。 FS + Rapa+ DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)量增加，IGF1應(yīng)用后降低（圖3 A）。未觀察到M2標(biāo)記精氨酸酶-1的表達(dá)發(fā)生變化。在FS + Rapa+ DMSO組中，M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA水平一致升高，IGF1應(yīng)用后下降，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 的mRNA表達(dá)無變化（圖3 C）。
此外，F(xiàn)S + 3-MA + DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)下降。應(yīng)用GSK690693后，TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上顯著增加（圖3 B）。在FS + 3-MA + DMSO組中，iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平一致下降，應(yīng)用GSK690693后升高，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 表達(dá)無變化（圖3 D）。這些數(shù)據(jù)表明，機械力刺激的PDLSCs中的自噬激活通過抑制AKT信號通路誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。
總之，PDLSCs中機械力刺激的自噬通過抑制AKT信號通路引導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M1表型，從而有助于骨重建和牙齒移動（圖4）。這些結(jié)果有助于更好地了解PDLSCs如何響應(yīng)機械刺激并與巨噬細(xì)胞極化的相互作用，從而調(diào)節(jié)牙槽骨骨重建。研究結(jié)果還表明，調(diào)節(jié)MSC自噬可能調(diào)節(jié)炎癥性骨重建和再生過程。
參考文獻(xiàn)：Jiang N, He D, Ma Y, Su J, Wu X, Cui S, Li Z, Zhou Y, Yu H, Liu Y. Force-Induced Autophagy in Periodontal Ligament Stem Cells Modulates M1 Macrophage Polarization via AKT Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021 May 26;9:666631. doi: 10.3389/fcell.2021.666631. PMID: 34124048; PMCID: PMC8187804.
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。
自噬已逐漸被認(rèn)為是在外部刺激（例如應(yīng)激，炎癥，缺氧和機械負(fù)荷）下維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)的重要保護(hù)性細(xì)胞過程。此外，自噬也可能適應(yīng)機械負(fù)荷，可以在成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和 PDLSC s等機械敏感細(xì)胞中被激活。然而，PDLSCs中的自噬是否影響機械力刺激下牙周組織的炎癥微環(huán)境需要進(jìn)一步探索。
在機械力誘導(dǎo)的炎癥骨重建過程中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是重要的免疫細(xì)胞之一。在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，其表現(xiàn)出獨特的表型和功能：經(jīng)典型巨噬細(xì)胞極化主要由M1型巨噬細(xì)胞構(gòu)成，表現(xiàn)出與炎癥和細(xì)胞毒性相關(guān)的功能，另一型巨噬細(xì)胞極化主要由M2型巨噬細(xì)胞構(gòu)成，與組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。研究已經(jīng)證實，M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動期間的骨重建和牙根吸收過程中至關(guān)重要。
鑒于M1巨噬細(xì)胞極化在牙齒移動過程中的重要性，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科聯(lián)合團(tuán)隊的一項研究曾假設(shè)PDLSCs中的自噬在機械力刺激下影響巨噬細(xì)胞極化，從而影響牙槽骨重建，研究旨在驗證PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬是否以及如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，并有助于牙周炎微環(huán)境和牙齒移動過程中的骨重建。
PDLSCs中力誘導(dǎo)的自噬有助于體內(nèi)M1巨噬細(xì)胞極化
為了研究機械力是否可以激活自噬，建立了牙齒移動的實驗動物模型，并使用抑制劑3-MA阻斷自噬。機械力刺激7天后，牙齒移動距離增加，而注射3-MA可縮短此距離（圖1 A）。機械力刺激后，自噬蛋白LC3、促炎細(xì)胞因子TNF-α和MSC表面標(biāo)志物CD146在牙周組織受壓側(cè)的表達(dá)增加。同時，TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量也增加（圖1 B、C）。3-MA可顯著降低LC3、TNF-α和CD146的表達(dá)，以及TRAP+ 破骨細(xì)胞的數(shù)量。盡管如此，與對照組相比，機械力+3-MA組CD146 + MSCs 和TRAP+ 破骨細(xì)胞數(shù)量仍上調(diào)（圖1 B、C）。
為了評估力誘導(dǎo)自噬對體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化的影響，進(jìn)行了免疫熒光染色以鑒定力刺激后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的變化。受力刺激后牙周韌帶受壓側(cè) CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，3-MA注射后顯著減少。雖然機械力+3-MA處理后CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，但受力刺激后M1/M2巨噬細(xì)胞極化比顯著增加，3-MA注射后顯著降低（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明，自噬調(diào)節(jié)機械力刺激后的巨噬細(xì)胞的極化，并影響牙槽骨重建和牙齒移動過程。
圖1 機械力誘導(dǎo)的自噬有助于體內(nèi)牙齒運動過程中的M1巨噬細(xì)胞極化和骨重塑。
機械力激活PDLSCs中的自噬
為了探索機械力下的自噬活性，在體外對PDLSCs進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光染色自噬通量測定和TEM。LC3是最重要的自噬相關(guān)蛋白之一。在12 小時的0.5-2.5 g/cm2的壓縮力負(fù)荷下，LC3II/I的表達(dá)增加。然而，1.0和1.5g/cm2的壓縮力觸發(fā)了LC3II/I 的zui強表達(dá)，隨后在實驗中使用 1.5g/cm2 壓縮力。
壓縮力刺激3 h后LC3II/I的表達(dá)量開始增加，并持續(xù)至24 h。此外，在壓縮力刺激2、6h后，另一種自噬標(biāo)志物P62/SQSTM（P62）的表達(dá)下降，而Beclin1的表達(dá)在力刺激3h后增加。實時熒光定量PCR顯示，與對照組相比，Beclin1的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。免疫熒光染色顯示，在壓縮力刺激12h后，PDLSCs中聚集的LC3陽性表達(dá)，在雷帕霉素應(yīng)用后進(jìn)一步增強。
用壓縮力刺激細(xì)胞12 h，用顯微鏡檢測自噬通量。結(jié)果表明，自噬溶酶體和自噬體的數(shù)量顯著較高。此外，壓縮力刺激后，TEM可在PDLSCs中發(fā)現(xiàn)明顯的自噬體。這些數(shù)據(jù)表明，在壓縮力刺激下，PDLSCs的自噬可以在壓縮力依賴性和時間依賴性趨勢中被激活。
力刺激的PDLSC自噬在體外誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化
為了進(jìn)一步檢測力刺激的PDLSCs中的自噬是否會影響巨噬細(xì)胞極化，使用來自機械力刺激的PDLSCs（FS）、機械力刺激的PDLSCs + 3-MA處理（FS + 3-MA）或自噬激活劑雷帕霉素（FS + Rapa）的上清液來處理THP-1來源的巨噬細(xì)胞，無力加載作為對照（CS）（圖2 A）。
FS組THP-1來源巨噬細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，在FS + 3-MA組下調(diào)，而FS + Rapa組進(jìn)一步上調(diào)。然而，未觀察到M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1的表達(dá)（圖2 B）。
免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，F(xiàn)S組CD68 + iNOS + M1巨噬細(xì)胞比例顯著增加，在FS + 3-MA組部分被阻斷，而FS + Rapa組增強。然而，CD68 + CD163 + M2巨噬細(xì)胞的比例沒有改變（圖2 C、D）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，F(xiàn)S組M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS的表達(dá)顯著增加，在FS + 3-MA組下調(diào)，而FS + Rapa組上調(diào)（圖2 E）。然而，M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1的表達(dá)沒有改變（圖2 E）。僅應(yīng)用3-MA或雷帕霉素不會改變THP-1巨噬細(xì)胞中TNF-α或精氨酸酶-1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，在機械力刺激的PDLSCs中，自噬可以在體外引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。
圖2 力刺激的PDLSC自噬在體外誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。
牙周膜干細(xì)胞自噬通過抑制AKT信號通路調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞極化
在驗證了PDLSC自噬與巨噬細(xì)胞極化之間的關(guān)系后，實驗最后探討了其潛在機制。AKT信號通路已被公認(rèn)為巨噬細(xì)胞存活和極化的關(guān)鍵介質(zhì)。作為巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 活性的增加引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化。
實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將條件培養(yǎng)基應(yīng)用于THP-1來源的巨噬細(xì)胞中時，F(xiàn)S組中磷酸化-AKT的表達(dá)受到顯著抑制，而3-MA（FS + 3-MA）阻斷自噬會增加磷酸化-AKT的表達(dá)，雷帕霉素增強自噬逆轉(zhuǎn)了上述磷酸化-AKT水平的增加。相比之下，在機械力刺激的PDLSCs的上清液中孵育后，NF-κB / P65的表達(dá)上調(diào)，雷帕霉素進(jìn)一步增強。
為了進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控機制，將AKT信號激活劑IGF1和抑制劑GSK690693應(yīng)用于THP-1衍生的巨噬細(xì)胞。 FS + Rapa+ DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)量增加，IGF1應(yīng)用后降低（圖3 A）。未觀察到M2標(biāo)記精氨酸酶-1的表達(dá)發(fā)生變化。在FS + Rapa+ DMSO組中，M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物iNOS和TNF-α的mRNA水平一致升高，IGF1應(yīng)用后下降，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 的mRNA表達(dá)無變化（圖3 C）。
此外，F(xiàn)S + 3-MA + DMSO組TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)下降。應(yīng)用GSK690693后，TNF-α和NF-κB/P65的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平上顯著增加（圖3 B）。在FS + 3-MA + DMSO組中，iNOS和TNF-α的mRNA表達(dá)水平一致下降，應(yīng)用GSK690693后升高，而M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物精氨酸酶-1和DECTIN-1 表達(dá)無變化（圖3 D）。這些數(shù)據(jù)表明，機械力刺激的PDLSCs中的自噬激活通過抑制AKT信號通路誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。
圖3 PDLSC中力誘導(dǎo)的自噬通過AKT信號通路調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞極化。
圖4 圖形概要。
總之，PDLSCs中機械力刺激的自噬通過抑制AKT信號通路引導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M1表型，從而有助于骨重建和牙齒移動（圖4）。這些結(jié)果有助于更好地了解PDLSCs如何響應(yīng)機械刺激并與巨噬細(xì)胞極化的相互作用，從而調(diào)節(jié)牙槽骨骨重建。研究結(jié)果還表明，調(diào)節(jié)MSC自噬可能調(diào)節(jié)炎癥性骨重建和再生過程。
參考文獻(xiàn)：Jiang N, He D, Ma Y, Su J, Wu X, Cui S, Li Z, Zhou Y, Yu H, Liu Y. Force-Induced Autophagy in Periodontal Ligament Stem Cells Modulates M1 Macrophage Polarization via AKT Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021 May 26;9:666631. doi: 10.3389/fcell.2021.666631. PMID: 34124048; PMCID: PMC8187804.
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。
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