優化和升級MelanotanⅡ(MT-Ⅱ)-黑皮質素受體激動劑的合成
摘要
α-黑色素細胞刺激激素（α-MSH）會觸發褪黑激素產生，這是人體應對紫外輻射刺激的天然保護措施。皮膚暴露在紫外輻射刺激下會促進α-MSH的產生。因此，在身體受到紫外輻射刺激之前，先刺激褪黑激素的生物合成可預防紫外輻射誘導的皮膚癌癥。[1]
天然的α-MSH在體內非常不穩定，因此作為治療劑的α-MSH多是它的類似物。[2-4]其中MT-Ⅱ（圖1），作為α-MSH的類似物，是一種環肽，不僅對酶的降解有良好的抗性，并且具有很強的效力。
因為MT-Ⅱ的現實意義和大規模生產需求，所以我們的工作重點是優化一種全自動的多肽合成途徑，比如多肽序列的線性合成及最終在樹脂上作肽的內酰胺化反應。在PurePep® Chorus多肽合成儀上，我們使用不同的肽合成策略全自動合成MT-Ⅱ，以探索最佳合成條件。然后選擇其中最優合成方式，利用PurePep® Sonata®+多肽合成儀對MT-Ⅱ進行合成放大。
實驗結果
利用PurePep® Chorus多肽合成儀探索合成條件，在多次合成實驗后發現，直接的合成方式并不是合成MT-Ⅱ的最佳選擇，因為直接合成過程總是會產生大量的天冬氨酰亞胺(aspartimide)副產物。因此，我們采取分步合成的方式，大大降低了副產物的產生，顯著提高MT-Ⅱ粗品的純度，并且發現其中方法G是最優的合成方式。
在優化合成方法后，利用PurePep® Sonata®+中試級多肽合成儀對其進行放大合成，最終在5 mmol的規模下成功合成了MT-Ⅱ。
這項工作結合了PurePep® Chorus 和 PurePep® Sonata®+兩款多肽合成儀，并且表現出了強大的合成流程開發能力、穩定的合成方法轉移放大效果。
結論
1 在PurePep® Chorus上實現MT-Ⅱ的全自動合成，包括側鏈脫保護和樹脂上環化
2 開發了合成的反應條件（方法G），以優化的耦合條件最大限度減少副反應發生
3 該方法被成功轉移到PurePep® Sonata®+進行擴大規模合成，并且保持了MT-Ⅱ的高粗品純度
實驗方法與分析
首先，通過多肽固相合成（SPPS）法，利用Fmoc/tBu保護方案，使用PurePep® Chorus（0.1 mmol）多肽合成儀多次合成MT-Ⅱ（Ac-Nle-Asp-His-dPhe-Arg-Lys-NH2），并對不同的合成方法進行評估；當合成規模達到5 mmol時，利用新型PurePep Sonata+大規模多肽合成儀繼續進行擴大合成。
首先室溫下利用兩種不同的耦合方式（DIC/Oxyama和HCTU/DIPEA）在Rink Amide MBHA樹脂（0.35 mmol/g）上合成全長線性MT-Ⅱ【方法A：5當量的氨基酸；5當量DIC；5當量Oxyma Pure；方法B：5當量氨基酸；5當量HBTU；10當量DIPEA】。使用含20%哌啶的DMF溶液脫保護5分鐘，重復兩次。因為可順利合成，利用DIC/Oxyama耦合方式再次合成全長線性MT-Ⅱ，這次采用5分鐘預活化步驟【方法C：5當量氨基酸；5當量DIC；5當量Oxyma Pure；對氨基酸作預活化處理】。在這些合成過程中，Alloc和OAll作為賴氨酸和天冬氨酸的側鏈保護基，允許多肽在樹脂上環化。最后通過0.2當量的Pd(PPh3)4和24當量的PhSiH混合在DCM溶液中，室溫反應60分鐘，選擇性去除Alloc和OAll，反應后DCM清洗3次。樹脂上的環化反應，采用5當量PyOxim和10當量DIPEA的耦合溶液，在DMF中于室溫下反應60分鐘。
但是上述的合成方法都會導致大量的天冬氨酰亞胺(aspartimide)形成。為了抵消這種副反應的發生，我們設計出了一種新的合成路線，采用一種可選擇的正交保護基團。在這種新的合成路線中，全長線性MT-Ⅱ通過方法B在Rink Amide MBHA樹脂（0.35 mmol/g）上合成兩次，兩次合成使用兩種不同的側鏈保護基團的組合，【方法D：Lys（Mtt）/Asp（2-phenylisopropyloxy）】【方法E：Lys（ivDde）/Asp（ODmab）】。從方法D的結果來看，相比于前面所提到的常規方法（方法A、B、C），這種方法可以有效的降低天冬氨酰亞胺(aspartimide)的產生。與此同時，也需要注意的是，這種方法因使用了含特殊保護基的氨基酸相對成本較高。另一方面，方法E結果并不理想，可能還需要更多的探索。
為了消除天冬氨酰亞胺(aspartimide)的形成，也為了發現每一步合成發生了什么，所以采用逐步合成的方法。因此，首先使用方法C在Rink Amide MBHA樹脂（0.35 mmol/g）上合成0.1 mmol的線性MT-Ⅱ直到合成到組氨酸停止。在完成小試切割和分析之后，將合成樹脂分成兩份，每份0.05 mmol，然后使用兩種不同的耦合方式【方法F：DIC/Oxyama和方法G：HCTU/NMM，5當量的氨基酸、5當量的HCTU、10當量的NMM】將其與天冬氨酸繼續耦合，室溫反應，并且先進行5分鐘的預活化。在這個循環，當使用方法F的DIC/Oxyma耦合方式用于偶聯天冬氨酸時會出現天冬氨酰亞胺(aspartimide)，而使用 HCTU/NMM的耦合方式則不會顯著出現。為了避免在進一步形成天冬氨酰亞胺(aspartimide)，在該步去除正交保護基團，在樹脂上進行環化。兩個等分的樹脂使用各自的耦合化學反應（方法F:DIC/Oxyma，方法G：HCTU/NMM）繼續完成合成。
PurePep® Chorus
對各種方法進行比較，發現通過使用方法G在PurePep® Chorus多肽合成儀上合成MT-Ⅱ時天冬氨酰亞胺(aspartimide) 雜質明顯減少。于是選擇這種方式在PurePep® Sonata®+大規模多肽合成儀上進行5 mmol MT-Ⅱ的放大合成。再次使用Rink Amide MBHA 樹脂（0.35 mmol/g），考慮到相關成本會隨著多肽合成規模的擴大而增加，于是應用3倍的過量試劑進行合成，逐步合成分析。在此過程中發現D-Phe和Nle需要重復耦合以便提高偶聯效率，這種方法與原先在Chorus上的方法略有調整。合成方法的其他方面保留了一致性，并且取得了非常好的結果。
合成完成后，使用DMF和DCM將樹脂洗滌，干燥，然后利用TFA/EDT/H2O/TIS（94:2.5:2.5:1）室溫切肽1小時，乙醚沉淀。將收集的多肽溶于水/乙腈溶液中，使用Shimadzu Prominence HPLC進行收率分析，采用C18，100 Å，5 μm，100 × 4.6 mm Kinetex 色譜柱（Phenomenex），流速1 mL/min，流動相A緩沖液使用含0.1%TFA的超純水，B緩沖液使用含0.1%TFA的乙腈，用5-95%的B緩沖液進行梯度洗脫25分鐘，214 nm波長進行檢測。分子量分析采用Shimadzu LCMS-2020 Single-Quad質譜儀進行檢測，C18，100 Å，5 μm，50 × 2.1 mm的色譜柱（Agilent），流速1 ml/min，流動相A緩沖液使用含0.1%甲酸的超純水，B緩沖液使用含0.1%甲酸的乙腈，用5-95%的B緩沖液進行梯度洗脫20分鐘。
PurePep® Sonata®+
參考文獻
1. V. V. Ryakhovsky, G. A. Khachiyan, N. F. Kosovova, E. F. Isamiddinova and A. S. Ivanov, Beilstein J. Org. Chem. 2008, 4, 39.
2. F. Al-Obeidi, A. M. Castrucci, M. E. Hadley, V. J. Hruby, J. Med. Chem. 1989, 32, 2555–2561.
3. F. Al-Obeidi, M. E. Hadley, B. M. Pettitt, V. J. Hruby, J. Am. Chem. Soc. 1991, 111,3413–3416.
4. A. Todorovic, J. R. Holder, R. M. Bauzo, J. W. Scott, R. Kavanagh, Z. Abdel-Malek, C. Haskell-Luevano, J. Med. Chem. 2005, 48, 9, 3328–3336.
5. D0042170 From Small to Large Scale Optimizing and upscaling the synthesis of melanotan II (MT-II) - Melanocortin Receptor Agonist, on PurePep® Chorus and PurePep® Sonata®+.
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