胰島具有復雜的異質性和亞種群，包含異質性細胞、未成熟和成熟的亞群。由于胰島素是血糖的主要調節器，大多數關于胰島功能障礙的研究都局限于β細胞。然而，越來越多的證據強調了α、β和δ細胞在葡萄糖穩態中的協同相互作用^[1-3]。高脂肪飲食（HFD）是導致2型糖尿病的一種常見原因，它會導致胰島的代償性適應，隨著胰島功能損傷加劇，會使得病人的癥狀加重^[4-6]。目前迫切需要α、β和δ細胞亞群的細胞表面標志物，以探索肥胖進展和糖尿病發病過程中各亞群的組成變化，以及高脂飲食誘導胰島代謝的適應機制。

 

南京醫科大學第一附屬醫院內分泌科楊濤教授團隊在Diabetologia（IF=10.12）上發表了題為“Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice”的文章（點擊文末“閱讀原文”查看文獻）。

 

該研究采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）結合單細胞蛋白質組學分析，深入闡明了各α、β、δ細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態，為探索胰島內分泌亞群在健康和疾病中的命運和功能機制提供了基礎資源。

 

南京醫科大學第一附屬醫院付麒、蔣和敏、錢玙為本文共同第一作者，楊濤、徐寬楓研究員為共同通訊作者，華大科技質譜平臺為該研究提供了單細胞蛋白質組學分析服務。

 

 

 

研究思路及主要成果

 

圖1 研究流程圖

 

1、小鼠胰島細胞scRNA-seq

該研究將4周大的雄性小鼠隨機分成兩組，正常喂養（CD）組和高脂肪飲食（HFD）組，喂養8周，每周監測體重。8周的HFD誘導小鼠明顯肥胖，葡萄糖穩態受損，并誘導胰島素抵抗，HFD導致胰島團塊代償性增生，尤其是β細胞。研究人員利用高通量scRNA-seq分析了15,093個來自CD小鼠胰島的細胞和18,906個來自HFD喂養小鼠胰島的細胞，并聚成四種主要內分泌細胞，基于主要激素基因表達進行了注釋：4,069個α（Gcg）、14,108個β（Ins1）、1,698個δ（Sst）和666個PP（Ppy）細胞。

 

從HFD組與CD組比較的α、β、δ細胞的差異表達基因（DEGs）來看，α、β、δ細胞內質網蛋白加工明顯富集，炎癥相關通路在α細胞中特別豐富（圖2a），這表明炎癥反應對HFD誘導的代謝應激的重要性。在β細胞中，鈣轉運和離子通道調節途徑排在首位（圖2b），表明其與分泌功能相關。此外，在β和δ細胞中，氧化呼吸鏈、能量產生和代謝途徑都顯著富集。在δ細胞中，其他顯著受HFD影響的途徑是蛋白質降解和循環相關途徑（圖2c）。

 

圖2 HFD和正常組之間α（a）、β（b）和δ（c）細胞中DEGs富集的KEGG通路前20位

 

 

2、胰島細胞亞群的單細胞蛋白質組學分析

由于mRNA的表達不能完全反映細胞或器官的生物活性，全面的蛋白表達譜在胰島細胞亞群研究中是必不可少的。然而，傳統的蛋白質組學需要樣本量高，而小鼠胰腺中胰島細胞數量有限，流式細胞儀分類的細胞亞群產量低。

 

因此，該研究對胰島細胞亞群進行了單細胞蛋白質組學分析。首先，研究人員利用大量胰島樣品的譜庫，在數據依賴采集模式下進行質譜（MS）數據采集，鑒定出90,494個多肽和8,168個蛋白質。接下來，MaxQuant集成的Andromeda引擎識別了α、β和δ亞群的單細胞蛋白質組學樣本中的蛋白質。最終，在36個胰島細胞亞群樣本（2種飼料×3種內分泌細胞類型×2種細胞亞群×3個重復）中，研究人員鑒定出6,955個蛋白質和50,245個肽。

圖3 單細胞蛋白質組學分析示意圖

圖4 胰島細胞亞群間差異蛋白表達熱圖和富集KEGG通路

 

 

3、RNA測序技術結合單細胞蛋白質組學闡明各細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態

 

ACE2^low α細胞可能代表低容量、脆弱和對HFD應激易感性的狀態

為了探索ACE2為基礎的α細胞異質性的分子特征，在Ace2^low和Ace2^high亞群之間鑒定出379個DEGs，KEGG分析顯示，DEGs優先富集于氧化磷酸化、代謝途徑、α細胞分泌功能相關途徑和程序性細胞死亡、增殖途徑，表明Ace2表達可以區分不同功能和生存狀態的α細胞。與Ace2^high亞群相比，Ace2^low亞群與α細胞功能相關的基因表達下調，與β細胞特征相關的基因表達上調。這表明Ace2^low亞群可能代表未成熟的α細胞，這些細胞似乎具有β細胞樣特征。單細胞蛋白質組學進一步分析了ACE2^low α和ACE2^high α細胞HFD組和CD組之間的DEPs和富集KEGG通路。ACE2^low α細胞中下調的DEPs數量比ACE2^high α細胞多，且這些下調的DEPs富集在更多與代謝相關的通路中。這表明ACE2^low α細胞更容易受到高熱量應激的影響，可能是一組低容量、脆弱的α細胞，而ACE2^high α細胞可能代表小鼠的主要功能細胞群，它們能夠更好地承受高熱量應激。

 

CD81^high β細胞可能代表功能較弱的未成熟β細胞

為了分析β細胞的異質性，研究將β細胞聚為9個簇，并鑒定出前10個標記基因。研究發現CD81在β細胞簇中有差異表達，然后將9個β細胞簇分為CD81^low和CD81^high亞群。CD81^low亞群相對于CD81^high亞群，DEGs和富集的KEGG通路顯示細胞代謝通路以及一系列應激相關的炎癥通路均顯著富集。關鍵的β細胞轉錄因子Mafa和β細胞成熟標記物在CD81^low亞群中有高mRNA表達，而未成熟β細胞標記物在CD81^high亞群中有高表達，這表明CD81^high亞群可能代表了一組功能弱且未成熟的β細胞。

 

為了進一步探索HFD對β細胞亞群的影響，FACS顯示與CD小鼠相比，HFD小鼠中CD81^high β細胞的比例下降。在CD小鼠中檢測到869個上調和373個下調的DEPs，在HFD小鼠中檢測到707個上調和312個下調的DEPs（圖5a、b）。CD81^low亞群中與能量代謝相關的途徑都被下調（圖5 c、d）。HFD和CD β細胞的scRNA-seq中，參與這些通路的下調的DEPs也降低了，結果反映了轉錄組和蛋白質組的一致性。此外，在CD和HFD小鼠中，與β細胞成熟和功能維持相關的關鍵轉錄因子PDX1在CD81^low細胞中相對于CD81^high細胞顯著上調（圖5e、f），在CD81^low細胞中，內吞作用、吞噬體、蛋白酶體和突觸囊泡循環通路中富集的DEPs大多上調，表明CD81^low細胞處于更成熟的狀態。

圖5 β細胞亞群功能的單細胞蛋白質組學鑒定

 

HFD增強了成熟GLUT2^low δ細胞的功能

盡管Slc2a2（編碼GLUT2）是β細胞的標志基因，但研究人員仍然在scRNA-seq中發現了一小群Slc2a2相對高表達的δ細胞，因此將δ細胞分為Slc2a2^low和Slc2a2^high亞群。根據Slc2a2^low亞群和Slc2a2^high亞群中的DEGs和富集通路，上調通路與鈣離子和激素分泌有關，提示Slc2a2^low亞群可能功能更成熟。來自CD和HFD小鼠的FACS分選GLUT2^low和GLUT2^high δ細胞亞群（每個樣品3,000個細胞）用于單細胞蛋白質組學分析，KEGG分析顯示，與β細胞相似，在CD小鼠中GLUT2^low細胞中，相對于GLUT2^high細胞，氧化磷酸化和阿爾茨海默病通路顯著下調（圖3c）。CD和HFD小鼠GLUT2^low細胞中的多種營養代謝途徑也顯著上調（圖3c，d）。內質網相關途徑的內吞作用和蛋白質加工也是如此，表明GLUT2^low亞群的代謝更活躍。在GLUT2^low δ細胞中，比較HFD和CD小鼠，代謝相關通路、鈣信號通路、胰腺分泌、胰島素和胰高血糖素信號通路顯著上調，表明HFD促進了GLUT2^low δ細胞的能量代謝。綜上，GLUT2^low δ細胞可能比GLUT2^high δ細胞更具有功能和代謝活性，HFD進一步刺激GLUT2^low δ細胞的功能和代謝。

 

圖6 δ細胞亞群功能的單細胞蛋白質組學鑒定

 

總 結

ACE2、CD81和GLUT2作為表面標記物分別區分成熟度和功能狀態不同的α、β和δ細胞亞群。在HFD誘導的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2^low α細胞比例隨著功能活躍和成熟CD81^low β細胞比例的增加而增加。成熟的GLUT2^low δ細胞功能增強，但比例不變。這些動態變化揭示了胰島在HFD應激下的代謝可塑性，這種可塑性適應可以通過抑制α細胞的高血糖效應，增強β細胞的低血糖效應，以及增加δ細胞對α和β細胞的調節來抵消代謝應激，恢復葡萄糖穩態。因此，靶向上述標志物改變胰島亞群分布，以增強胰島功能可能是治療糖尿病的有效方法。

 

圖7 小鼠胰島細胞（α、β和δ）亞群在HFD誘導下的胰島功能紊亂

 

科技君點睛

本研究利用單細胞RNA測序技術（scRNA-seq）在HFD誘導的葡萄糖耐受小鼠模型中鑒定α、β和δ細胞亞群標記物，通過流式細胞儀和免疫染色對各亞群的比例進行分類和評估，并對分選細胞進行單細胞蛋白質組學分析，通過蛋白表達深入闡明各α、β、δ細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態。

 

參考文獻：

[1] Control of insulin secretion by cholinergic signaling in the human pancreatic islet. Diabetes. 2014

[2] Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nat Med. 2015

[3] δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. J Physiol. 2018

[4] Body-mass index and obesity in urban and rural China: findings from consecutive nationally representative surveys during 2004–18. Lancet. 2021

[5] Epidemiology and determinants of obesity in China. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021

[6] Ethnicity-specific BMI cutoffs for obesity based on type 2 diabetes risk in England: a population-based cohort study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021