圖一  果蠅觸角與纖毛放大示意圖
 

盡管這些蛋白質具有重要作用，其功能上的精確機制尚未得到很好的理解。在文獻里許多基于體外生化測定的研究發現，這些蛋白質有大量的配體和配體結合區域。在其他研究中,有證據表明配體/CD36 蛋白相互作用可能參與調節配體在膜上的易位和受體介導的配體內化。然而，這些未被發現的 CD36 蛋白生化特性的相關性尚未在其原生環境中得到廣泛驗證。

一個特別受關注的遺傳學模型地中海黑腹果蠅已知有14個CD36樣的蛋白質，因此提供了一個有用的系統來研究CD36 蛋白質在體內的功能。其中一個果蠅 CD36 家族成員稱為感覺神經元膜蛋白1(SNMP1)，表達在嗅覺感知神經元(OSN)中，具有檢測脂源信息素的功能。SNMP1通常存在于昆蟲的樹突狀纖毛中，氣味受體(ORs，圖一) 也位于這里。在OSN中，已知果蠅 SNMP1 的功能是檢測雄性信息素(Z)-1-八度乙酸 (cis-vaccenylacetate,  cVA) 。缺乏 SNMP1 時會降低這些神經元對cVA 刺激的敏感性。因此，SNMP1 在此信號通路中起著重要的作用，但其作用機制尚不明確。盡管如此，SNMP1與細胞外脂質配體的相互作用進而引發信號通路下游反應，與哺乳動物 CD36 在脂肪味覺感知、病原性細菌脂質、脂蛋白的免疫識別方面類似1,2。因此，SNMP1 為理解體內 CD36蛋白提供了一個相關的模型。

因為具有無標記和實時監測的特點，表面等離子共振(SPR) 技術在研究生物分子相互作用時有明顯優勢。在這篇應用筆記里，我們將說明如何用 P4SPR 來研究不同昆蟲信息素和 CD36 蛋白的結合作用，提供一個分子遺傳學，細胞生物學，生化，電生理學和同源建模的補充技術來表征SNMP1 的結構功能。最終的目標是綜合概述跨膜蛋白在興奮劑的刺激下所顯示的作用機制。

實驗設置
P4SPR 設備設置

圖二  P4SPR與蠕動泵相連工作示意圖

USB供電個人型四通道 SPR (P4SPR) 連接到筆記本后可經過P4SPR控制軟件控制和記錄數據。蠕動泵模塊可輕松集成到 P4SPR 實驗中，以確保穩定的液流到 SPR 芯片上( 圖二) 。實驗開始前需要先把Au SPR芯片插入P4SPR 的流動池支架中。PDMS 微流體單元放置在 SPR 芯片頂部，并在 P4SPR 蓋上牢固地施加壓力以避免任何液體泄漏。為設備進行實驗的設置流程不多于 5分鐘的準備時間。

實驗程序

圖三   CD36傳感芯片及其與小分子相互作用SPR實驗示意圖

首先Au SPR芯片的表面涂有肽自組裝的單層以結合帶有His標簽的蛋白質，其功能類似于Ni-NTA。由于SNMP1的胞外域難以表達，鑒于結構特征的同源性，本研究過程使用哺乳動物CD36作為結合研究的替代品。高濃度的 His-tagged 標記的CD36蛋白溶液在芯片表面孵育15分鐘后完成CD36的固定 (圖三)。實驗中總共研究了9個信息素分子與CD36蛋白的結合相互作用。配體在 PBS 中制備的濃度在亞uM和mM之間。PBS中加入0.1%的二甲基硫氧化物提高疏水配體的溶解度。從固定到分析的每個SPR步驟都可實時監控。配體溶液從低濃度到高濃度依次注入。每個配體的分析時間是 30 分鐘，其中包括 6 種不同的濃度流經P4SPR。SPR 位移在熱力學平衡后做記錄并繪制，以確定每個配體的親和曲線。平衡解離常數 (KD)和最大SPR信號可通過Matlab擬合 Langmuir 等溫線到親和力曲線來提取。

結果和討論
SPR傳感器圖

圖四  SPR傳感圖：法呢醇(濃度:0.29-73.4uM)和cVA (濃度: 0.33-83.7uM) (左)；
(Z)-11-16 烯醛(濃度: 0.18-47.0uM)和乙酸異戊酯(濃度: 0.32-327uM) (右)

SPR 傳感圖的結果顯示隨著法呢醇，CVA 和(Z)-11-16烯醛濃度增加，SPR 位移也相對增加。對于乙酸異戊酯未觀察到 SPR 位移表明與CD36幾乎沒有結合。

配體濃度-響應曲線與 KD 比較
為了比較，我們建立了各種分析物的濃度響應曲線。通過SPR 檢測，5個信息素分子顯示與CD36結合（圖五）。檢測CVA、法呢醇和(Z)-11-16 烯醛得到的解離常數和一些已知的CD36結合肽的檢測結果在相同量級(圖六)³
 

圖五  所示配體的 ΔλSPR 濃度-響應曲線，用于計算相應的平衡解離常數
 

圖六  化合物的 KD 和最大 SPR 信號 (ΔλSPR,max)

特異性和靈敏度
信息素與CD36相互作用的特異性在本文中得到驗證。已知僅激活非 SNMP1 表達神經元（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯或丁酸乙酯）的其他刺激物無顯著相互作用（圖六），表明了昆蟲信息素與 CD36 外域直接結合的證據。此外，P4SPR 對研究 88-250Da 之間分子量配體的結合具有足夠的靈敏度。這表明 P4SPR 能夠通過相關的表面修飾獲得互作檢測的特異性，并能檢測低分子量的小分子。

P4SPR優勢
Affinité instruments 的P4SPR是一個模塊化、個人型的多通道分子互作系統，用于提供對這些跨膜蛋白在信息素刺激下的作用機制的基本理解。它的模塊化允許與液流傳輸系統輕松集成。多通道特性提高了測量精度，其靈敏度允許檢測低分子量的小分子。對于采用多種方法來理解生物功能背后的作用機制的綜合研究，特異性強、靈敏度高且用戶友好的P4SPR 系統非常適合于快速收集SPR 數據來表征結合相互作用。

結論
P4SPR 提供的相互作用結合信息，進一步證明了信息素與跨膜蛋白的直接結合，其是信息素在細胞內的隧道效應的主要來源。P4SPR 為不同信息素和 CD36 的結合作用和特異性提供了寶貴的信息，進一步揭示了其作用機制。

參考文獻

【1】Hoebe, K. et al. CD36 is a sensor of diacylglycerides. Nature 433, 523–527 (2005)

【2】Laugerette, F. et al. CD36 involvement in orosensory detection of dietary lipids, spontaneous fat preference, and digestive secretions. J. Clin. Invest. 115, 3177–3184 (2005).

【3】Bolduc, O. R. et al. Modified peptide monolayer binding His-tagged biomolecules for small ligand screening with SPR biosensors. Analyst 136, 3142–3148 (2011).