摘要

反相蛋白微陣列 (RPPA) ，已被證明是對大型患者隊列進行生物標志物評估的有用工具。使用經過驗證的抗體，可在單個實驗跟蹤細胞命運的生物標志物。這項技術的挑戰之一是動態范圍，因為在同一隊列中，生物標志物的表達水平可能從飛摩爾 (fM) 到微摩爾 (µM) 濃度不等。已經開發了幾種技術來跟蹤生物標志物的表達。熒光檢測已被證明較比色和化學發光檢測更靈敏。然而，所有這些技術都必須進行優化以克服動態范圍有限的挑戰。一種解決方案是對樣品進行連續稀釋。然而，這增加了 RPPA 的復雜性，并使數據解析非常繁瑣。此外，連續稀釋會增加 RPPA 成本，因為每個實驗需要幾張芯片。這里，我們將描述從比色檢測到熒光檢測的方法轉變過程中，如何使用 InnoScan 710-IR 掃描儀動態范圍擴展 (XDR) 功能，大幅降低 RPPA 成本。

正文

蛋白質被認為是細胞對內源性或外源性刺激反應的主要效應分子。當刺激發生時，細胞通過調節“關鍵”蛋白質的表達來改變細胞功能。這些“關鍵”蛋白質被稱為生物標志物。反相蛋白質微陣列 (RPPA) 旨在跟蹤數百或數千個樣本中的生物標志物。在 RPPA 技術中，細胞裂解物被點在載玻片上，并通過使用經過驗證的抗體，以非常簡單的方式檢測生物標志物的表達（圖 1）。 RPPA其實就是小型化斑點印記（dot blots）實驗。
為了在免疫檢測中對蛋白質成像，使用標記的二抗。二抗可以與熒光蛋白（熒光團）或堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過氧化物酶 (HRP) 等酶結合。在酶檢測中，當添加酶底物時，有色沉淀物沉積在載玻片上（比色檢測）或形成化學發光產物，其光信號被適當的檢測器捕獲（化學發光檢測）。在熒光檢測中，在免疫檢測過程中直接使用標記有熒光團的一抗或二抗。在這種情況下，可以使用適當的掃描儀（例如Innopsys 的 InnoScan 掃描儀），進行熒光信號檢測。與比色法和化學發光檢測相比，熒光檢測已被證明具有多項優勢；主要優點是靈敏度和動態范圍。






























圖 1.RPPA 工作流程。橙色標記了影響耗材成本的關鍵步驟。連續稀釋樣品會增加成本；帶或不帶 XDR 檢測的熒光檢測將 RPPA 總體成本降低了至少 30%。




圖 2. 動態范圍擴展 (XDR)。為了解決樣品間蛋白質表達水平差異大的問題，Innopsys 開發了一種掃描模式，可以在保持微弱信號的同時避信號飽和。 A) 以手動模式掃描的 RPPA 芯片；圖像是動態范圍為 10⁴ 的 16 位 TIF 圖像。 B) 使用 XDR 掃描模式掃描的同一芯片；圖像是動態范圍高于 10⁶ 對數的 20 位 TIF 圖像


熒光檢測的動態范圍是化學發光檢測的 10 倍，因此檢測限內的線性更好，使信號量化更準確。RPPA實驗 的最大挑戰之一是檢測蛋白表達變化所需的動態范圍。一些生物標志物的動態范圍可達 10⁶，這意味著它們可以在某些樣品中以飛摩爾 (fM) 濃度存在，而在其他樣品中以微摩爾 (µM) 濃度存在。10⁶ 動態范圍超出了具備10³ 或 10⁴ 動態范圍檢測設備的檢測范圍。為了克服這個問題，應該對每個樣品進行連續稀釋以擴大檢測動態范圍，但必須使用信號放大系統來檢測弱表達的生物標志物。此過程使數據分析和解析更加復雜，因為每個樣品都需要五個或更多稀釋梯度才能包含在分析中。此外，連續稀釋樣品會增加測定成本，因為實驗所需的載玻片數量會增加一倍或三倍，從而增加耗材成本。 Innopsys 通過在其掃描儀型號中加入動態范圍擴展 (XDR) 模式解決了這個問題。使用 XDR 模式，信號檢測動態范圍從 10⁴擴展到 10⁶ 以上，因此能夠在單次掃描中檢測低信號和高信號（圖 2）。XDR 模式已被證明可以保持不同樣本之間的數據分布不變，這在比較來自不同樣本的信號時必不可少。 借助 XDR 功能，不再需要連續稀釋，從而減少了每次實驗的載玻片數量，從而降低最終成本。

圖 3 描述了一個 RPPA 實驗室以每年生產約 300 張芯片的成本估算。在此示例中，參考實驗室估計，使用熒光檢測可以通過進行相同的樣品系列稀釋，為相同數量的載玻片節省大約 30% 的耗材成本。通過 InnoScan 710-IR 掃描儀熒光檢測和 XDR 掃描模式，載玻片數量減少 3 倍，耗材成本降低90%。




圖 3. 年耗材成本估算。我們的參考實驗室估算了 300 張載玻片的年耗材成本，并比較了不同的檢測方法。成本以美元表示，并根據 2014 年耗材目錄價。通過使用近紅外 (NIR) 熒光檢測代替比色檢測，可將耗材成本降低 30%。通過使用 NIR 熒光檢測結合 XDR 掃描模式，載玻片數量可以減少 3倍，與比色檢測相比，成本節省高達 90%。


總之，熒光檢測已被證明是一種有用的檢測工具，具有以下幾個優點：(i) 多重檢測：使用不同顏色的熒光團同時檢測同一張載玻片上的兩種或多種目標蛋白。(ii)靈敏度：近紅外檢測幾乎消除了背景信號，因此與可見熒光檢測相比，信噪比提高了 4 倍。它還可以在沒有信號放大系統的情況下檢測弱表達的蛋白質。 (iii) 動態范圍：通過使用適當的檢測器（例如光電倍增管 PMT），可以提高靈敏度和動態范圍。在這里，我們已經證明，通過使用 InnoScan 710-IR 的 XDR 掃描模式，RPPA 實驗成本顯著降低，從而使 RPPA 適合對大型隊列中的生物標志物進行精確分析。