文獻解讀：結直腸癌和肝轉移之間的免疫表型聯系
導語
腫瘤微環境(TME)的各種免疫細胞類型影響癌細胞的進展和轉移。TME的多個方面，包括密度、位置和功能狀態，被認為是與預后和免疫治療反應性相關的重要因素。快速發展的單細胞RNA測序技術加速了腫瘤內不同細胞群和表型狀態的識別，為揭示不同癌癥類型之間的TME差異提供了前所未有的機會。例如，CD8+耗竭T細胞（Texs）在肝細胞癌（HCC）和結直腸癌（CRC）中的分數遠高于肺癌。此外，在膠質瘤中，駐留巨噬細胞顯著，而轉移性腦瘤中浸潤巨噬細胞更為豐富。因此，越來越多的證據表明不同類型的癌癥具有不同的TME，有幾個因素可能影響TME，包括體細胞突變、種系變異、表觀遺傳調節和微生物成分。原則上，不同類型癌癥的TME差異可能是由生態位（局部組織微環境）和惡性腫瘤（癌細胞特性）共同引起的，對不同的免疫成分有不同的影響。然而，由于它們對給定腫瘤的TME的影響是交織在一起的，因此很難辨別局部組織微環境或惡性腫瘤的相對貢獻。
在這里，本文對51例未經治療的CRC肝轉移（CRLM）和原發性HCC/CRC患者的201個臨床樣本進行了scRNA-seq分析，并研究了他們的免疫細胞組成和轉錄動態。本文量化了局部組織微環境和惡性腫瘤對CRLM TME內免疫細胞的影響，并確定樹突狀細胞（DC）和自然殺傷細胞（NK）的表型與肝臟微環境相關，而T細胞和B細胞以及巨噬細胞表現出較高的異質性。特別是，SPP1+腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和最近報道的DC人群DC3s被認為是惡性腫瘤驅動的，與CRC患者的不良預后相關。本文的研究證明了TME、癌癥類型和宿主器官之間復雜的相互作用，為未來TME如何形成和治療控制提供了見解。
科學問題
利用單細胞測序探索結直腸癌肝轉移（CRLM）的免疫圖譜，了解可能塑造TME的內在和外在因素，研究腫瘤微環境在原發位點和轉移位點之間的免疫細胞的聯系。
研究技術
scRNA-Seq、mIHC（多色熒光免疫組化）
研究思路
研究結果
1. CRLM, HCC, and CRC 樣本數據收集及免疫特征
對于CRLM，文章共獲取了來自101個匹配樣本的CD45+細胞的scRNA-seq數據，這些匹配樣本包括原發性結直腸腫瘤（Pri.CT）、鄰近結腸（Adj.Col）、腸系膜淋巴結（MLN）、肝轉移（Liv.Mets）、鄰近肝臟（Adj.Liv）和17例初治患者的外周血。文章分別基于10x Genomics和Smart-seq2獲得了323,444和5,004個單細胞的高質量轉錄組。10X 5'和3'平臺都捕獲了大多數主要的免疫細胞，包括CD4+和CD8+ T細胞、單核細胞、巨噬細胞、NKT細胞、NK細胞、γo T細胞、DC、肥大細胞、B細胞、3型先天淋巴樣細胞（ILC3s）和少量CD45-細胞（圖1）。此外，使用Scanpy在每個主要細胞群中進行無監督聚類，共鑒定出78個免疫細胞亞群（圖1B和1C）。由于同時分析原發性HCC/CRC和CRLM腫瘤對于解剖癌細胞和器官在形成TME時的相互作用至關重要，文章結合了來自18例初治非轉移性CRC患者的49例樣本和16例初治非轉移性HCC患者的51例樣本的scRNAseq數據。為了統一所有數據，本文使用SciBet對CRC和HCC樣本的scRNA-seq數據進行了重新聚類，這使本研究能夠基于CRLM數據集預測細胞類型。
圖1 CRLM, HCC, and CRC 樣本數據收集及免疫特征
2. 利用表型比對方法解開癌細胞和宿主器官對TME的影響
在沒有CRLM數據的情況下，本文單獨對原發性HCC/CRCs的正常和腫瘤數據進行了方差分析，以確定某些免疫細胞群是否傾向于與正常/腫瘤狀態或肝臟/結腸位置相關（圖2A）。文章發現CD4_Treg-CTLA4，CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC是與宿主組織腫瘤或正常相關的前三個聚類（p< 0.001, ANOVA檢驗;圖2A），在HCC和CRC腫瘤中均表現出高于相應鄰近部位的浸潤（圖2B）。這表明這些細胞可能受到惡性狀態的影響。此外，CD8-MKI67、CD4_Treg-IL10和Mph-SPP1也受到腫瘤的影響（p< 0.01, ANOVA檢驗;圖2A）其中，與Adj.Cols和HCC腫瘤相比，Mph-SPP1在CRC腫瘤中富集（圖2B）。KLRB1+組織常駐記憶（Trm)）CD8+T和黏膜相關不變T細胞（MAIT）在HCC腫瘤和Adj.Livs中占主導地位，而上皮內淋巴細胞（iel）和Mph-NLRP3在CRC腫瘤和Adj.Cols中表現出更高的豐富度（圖2A）。這表明這些細胞可能受到了居住組織的影響。雖然HCC和CRCs之間的直接比較顯示惡性腫瘤和器官微環境可能共同形成免疫浸潤，但由于癌癥類型之間的組間差異，>50%免疫亞群（如Th17和cDC2簇）也明顯與惡性腫瘤或器官微環境無關（圖2A）。在解釋惡性腫瘤的影響時，HCC和CRC癌細胞之間的差異以及患者之間的遺傳背景差異也可能使結果復雜化。此外，基于方差分析的分析僅使用頻率信息，而忽略單細胞表達譜。因此，本文的目標是通過合并CRLM數據進行進一步分析來解決上述復雜性，因為相同的癌細胞譜系存在于同一患者的不同組織位置。
雖然方差分析可以利用樣本的統計學效力來說明免疫浸潤水平與惡性腫瘤及器官類型的關系，但由于每例患者作為一個樣本處理，樣本數較少，無法建立轉移部位免疫細胞與原發腫瘤及腫瘤鄰近肝組織免疫細胞之間的表型聯系。因此，因此本文設計PhenoAligner方法來剖析肝轉移免疫細胞與其他組織的表型聯系。PhenoAligner的假設是，在不同組織中具有相似轉錄組表型的細胞可能具有相似的微環境或生態位，因此可能共享外部調節因子以形成相似的表型。
在主要免疫細胞群體水平上，PhenoAligner顯示81%的CD45- Cells被歸類為原發性結直腸癌相關（圖2D），這與CD45人群中癌細胞的主要存在以及這些癌細胞的相同起源相一致。肥大細胞被定性為“惡性腫瘤相關”M型。NKT和NK細胞、DCs 和T 細胞被定義為N型（圖2D）。單核細胞和巨噬細胞被定義為C型（圖2D）。
圖2 利用表型比對方法解開癌細胞和宿主器官對TME的影響
3. CD8+耗竭細胞與惡性腫瘤相關且依賴于TCR
盡管CD8+T細胞在結直腸癌肝轉移中被分配為N型，根據PhenoAligner分析，他們的子集顯示出不同的模式(圖3A, 3B)。在所有CD8+ T簇中，兩個Tex簇Tex-LAYN和Tex- MKI67被鑒定為N型，因為它們的表型大多與原發性結直腸癌一致（圖3A）。這些Tex在兩個腫瘤位點也顯示富集。Tex-MKI67與Tex-LAYN共享多個T細胞受體（TCR）克隆型和相似的基因表達，也高表達增殖基因，因此，Texs主要受惡性細胞的影響。
為了進一步評估原發性結直腸癌和肝轉移部位T細胞是否同源，文章在原發位和轉移位中Tex-LAYN細胞群中分別識別到172和149種TCR克隆型，有42種在兩個癌點都有存在。表明Tex表現出惡性排他性，并且含有潛在識別腫瘤抗原的TCRs。令人困惑的是，Texs是如何從原發位“遷移”到轉移位的。據報道，Texs大都流動性非常低。一種可能的解釋是，兩個腫瘤部位的Texs起源于相同的前體，并以TCR依賴的方式對相同的癌癥相關抗原起反應。
為了進一步探究Texs在原發位和轉移位之間的關聯，文章進一步檢測了Tex和其他T細胞簇之間的TCR共享。結果顯示不僅Temras和效應記憶T細胞(Tems)之間存在TCR共享，Tems和Texs之間也存在TCR共享。此外，RNA速率分析顯示Temras和Tems之間存在雙向流動，而Tems向Texs的分化似乎是不可逆的(圖3F)。這些觀測結果表明，Tems具有高度塑性和中間性質，可能是M型Texs的前身。即DC呈遞抗原給Tn，分化為temra，分別到達原發灶和轉移灶的腫瘤位置，進而分化為tem，tem浸潤進腫瘤細胞并耗竭，無法再起到t細胞的作用。Tems的這種中間過渡可能是CD8+T細胞腫瘤浸潤過程中的重要橋梁步驟，并可能為之前提出的癌癥免疫周期提供新的見解(圖3G)。
圖3 CD8+耗竭細胞與惡性腫瘤相關且依賴于TCR
4. 結直腸惡性腫瘤和肝臟生態位對CD4+ T細胞亞群有不同的影響
接下來，本文對CD4+ T細胞進行了類似的分析，觀察到T輔助細胞（Th）17、Th1-like 、Treg-IL10和Treg-CTLA4被定性為M型（圖4A和4B）。Th17在原發位中富集，IL23R、RORC和ITGAE高表達。Th1樣高表達CXCL13和PDCD1。對于三個Treg群體，Treg- foxp3對應血液中的Treg，其他兩個對應組織中的Treg。在組織富集的Treg群體中，Treg-IL10高表達腸內Treg標記物，包括IL10、IL23R和IL1R1(圖4C)，在結直腸癌癌旁和結直腸癌原發灶中高度豐富，而在肝正常和肝轉移中罕見。相比之下，與Treg激活相關的Treg- ctla4高表達基因包括LAYN、CCR8和TIGIT（圖4C），與它們的免疫抑制性質一致。此外，與非轉移性CRC腫瘤相比，CRLM患者結直腸癌原發灶中Treg-IL10和Treg-CTLA4的比例明顯升高（圖4D），表明原發性CRC腫瘤伴隨肝轉移。與非轉移性CRC腫瘤相比，可能表現出更強的免疫抑制性，這與小鼠模型得出的結果一致。
從理論上講，這四種M型簇可以由播種癌細胞塑造，具有兩種不同的機制:起源于相同的前體，由癌癥相關的抗原觸發或被不同來源的癌細胞招募。Treg-CTLA4和Th1-like 中的TCRs在原發位和肝轉移之間顯示出顯著的共享。（圖4F）。值得注意的是，在所有CD4+T細胞簇中，只有Treg-CTLA4在原發位和肝轉移之間顯示出更高的STARTRAC-migr指數。Mets比腫瘤和其他組織之間的指數高（圖4H）。此外，兩個腫瘤位點的Treg-CTLA4與Treg-FOXP3共享TCR克隆型。此外，RNA速率分析顯示了從Treg-FOXP3到Treg-CTLA4的轉變方向（圖4l），這表明血液中靜止的Treg可能遷移到兩個腫瘤部位，然后在TME中被激活和擴張。與Th1-like和Treg-CTLA4不同，其余兩個簇（Treg-IL10和Th17）的TCRs在原發位和肝轉移之間表現出互斥模式（圖4G）。因此，這兩種機制都存在于CD4+T細胞中。Th17和Treg-IL10被不同來源的腫瘤細胞募集，而Treg-CTLA4和Th1-like來自同一前體。
圖4 結直腸惡性腫瘤和肝臟生態位對CD4+ T細胞亞群有不同的影響
結論
研究者更進一步探索了cDC2亞群的異質性，發現DC3和cDC2-TIMP1在腫瘤中富集，DC3傾向于富集在結直腸癌原發灶中，而cDC2-TIMP1則更多地出現于肝轉移灶中。過往的研究提到DC3在外周血、脾臟和扁桃體中存在，研究者首次在CRLM患者中發現該亞群，DC3和其他三個TAM亞群共同被歸類為M-type。C1QC+ TAM具有促炎性和抗腫瘤的特性，而SPP1+ TAM主要存在于轉移灶并且具有極高的促血管生成潛能，可以促進CRC腫瘤細胞的轉移。該研究為探索不同類型的腫瘤中免疫微環境的特異性和其形成原因提供了范式。
參考文獻：
Liu Y, Zhang Q, Xing B, Luo N, Gao R, Yu K, Hu X, Bu Z, Peng J, Ren X, Zhang Z. Immune phenotypic linkage between colorectal cancer and liver metastasis. Cancer Cell. 2022 Apr 11;40(4):424-437.e5. doi: 10.1016/j.ccell.2022.02.013. Epub 2022 Mar 17. PMID: 35303421.
