文章標題：Transcriptomics and metabolomics changes triggered by exogenous 6-benzylaminopurine in relieving epicotyl dormancy of Polygonatum cyrtonema Hua seeds
發表期刊：Frontiers in Plant Science
影響因子：6.627
作者單位：安徽農業大學
百趣提供服務：植物阿趣廣靶®代謝組學

研究背景
多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)是一種藥食同源的多年生植物，它是治療糖尿病和哮喘的重要中藥，含有類黃酮和多糖，對抗疲勞和治療糖尿病有一定作用。但是黃精種子具有“雙重休眠”的特征，即胚根休眠和上胚軸休眠；因此，在自然條件下，黃精種子需要經歷兩個冬天才能順利出苗，而且繁殖周期非常長，這大大限制了大規模種植。植物激素在植物休眠解除中起著重要作用，6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)是一種合成細胞分裂素，通常用于緩解植物的休眠。在本研究中，我們使用轉錄組學和代謝組學分析了外源6-BA處理后黃精種子的差異。

技術路線

研究結果 1、6-BA處理對黃精種子外觀和形態指標的影響

形態學觀察表明（圖1），黃精種子的發芽率隨著培養時間的延長而增加，當發芽率達到60%（30天）時，發芽率增長趨于穩定；當6-BA濃度為100～300mg/L時，效果明顯，最佳濃度為200mg/L。處理組在14天時種子相繼發芽，28天后出苗率達到60%以上，根部逐漸伸長。但從同一時期的水分對照組來看，進入上胚軸休眠后，上胚軸芽伸長不明顯，21天才開始有少量種子發芽，出苗率始終低于10%；但根生長迅速，14天后比處理組長。
 

圖1. 測定黃精種子種子發芽和出苗形態指標的測定

2、種子萌發過程中黃精的代謝特征
通過植物阿趣廣靶®代謝組學（由百趣生物提供）鑒定了21種樣品（0天-C0、12小時，7天，28天-C1/T1,C2/T2,C3/T3）代謝物的變化。在樣本中共檢測到1000種代謝物，包括229種差異代謝物(DEM)。PCA和Venn圖分析顯示（圖2A-D），不同時間段的處理組和對照組之間存在顯著差異，其中黃酮類物質存在顯著差異。

通過KEGG功能注釋分析發現，處理組和對照組在12小時、7天和28天標記了25、33和5條代謝途徑（圖2E-G）。可以看出，類黃酮生物合成途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑在三個階段顯著富集。此外，玉米素生物合成在前兩個階段也顯著富集，表明這些代謝途徑或代謝產物與休眠解除密切相關。
 

圖2. 黃精種子上胚軸休眠解除的代謝組學分析

3、黃精種子不同時期的轉錄組分析
使用與代謝檢測分析相同樣品，構建了21個cDNA文庫，并進行了高通量RNA-seq分析。通過三個不同階段的比較分析（圖3），作者總共獲得了31533個差異表達基因(DEG)。3486、2928和9293個DEG被發現是上調基因，而3213、5221和7392個DEG分別屬于下調基因（圖3A-B）。有2718、4544和6795個DEG分別在T1與C1、T2與C2和T3與C3的組間比較中差異表達。
 

圖3. 不同階段黃精種子的轉錄組學分析

4、代謝組學和轉錄組學方法分析了黃精種子上胚軸休眠解除過程

4.1、黃精種子上胚軸休眠解除過程中類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑中基因和代謝產物的變化（圖4）
在6-BA處理解除黃精種子上胚軸休眠的過程中，與同一時期的對照組相比，前7天通過抑制類黃酮生物合成途徑的基因和代謝產物來解除對芽分化的抑制，并促進生長素相關基因的表達，從而促進上胚軸芽的伸長。在后期，生長素合成基因的表達受到促進類黃酮相關基因和代謝產物的抑制，這進一步抑制了根系生長，促進了種子向種子出苗的轉化。也有報道稱類黃酮在種子萌發過程中積累，這表明，黃精種子上胚軸休眠解除和萌發的分子機制不同。

精氨酸和脯氨酸在植物休眠解除中起著重要作用。進一步分析表明，與同一時期的對照組相比，參與精氨酸生物合成的大多數基因和代謝產物在三個階段中均下調，這可能是因為脯氨酸在這兩個階段沒有保持高水平以促進芽伸長。因此，我們認為脯氨酸顯著增加了上胚軸芽的伸長，在上胚軸休眠的釋放起著重要作用。

玉米素是第一個被發現的植物天然細胞分裂素，我們分析了玉米素生物合成途徑的基因和代謝產物的表達模式。總體而言，在前7天，參與玉米素合成途徑的基因和代謝物普遍增加，28天后，相關基因和代謝物總體減少，并做了轉錄組信息驗證（圖4B–G）。
 

圖4. 生物合成途徑的轉錄組學和代謝組學分析。(A)DEG和DEMs在不同階段參與類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑。從藍色到黃色再到紅色的顏色梯度，代表基因的低、中、高FPKM。從紫色到黃色再到紅色的顏色梯度代表代謝物的低、中、高相對豐度。T：處理組；C：對照組。(B–G)通過qRT-PCR驗證轉錄組中的相關基因。IPT：異戊烯基轉移酶基因；CYP735A：細胞分裂素羥化酶基因；CKX：細胞分裂素降解酶基因；CHS：查爾酮合成酶基因；C4H：肉桂酸-4-羥化酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；“*”表示差異顯著，“**”表示差異非常顯著。

4.2、黃精種子上胚軸休眠解除過程中植物激素途徑的基因和代謝產物變化（圖5）

植物激素在植物休眠解除過程中起著重要作用，其中較為重要的是吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和細胞分裂素(CTK)。

作者對植物激素途徑中的DEGs進行計數，最后富集在GA、ABA和IAA代謝途徑中。本次研究結果與前人研究結果一致，表明上胚軸芽的伸長在黃精種子休眠解除中的關鍵作用；屬于CTK的玉米素生物合成途徑在黃精種子的上胚軸休眠解除中也發揮了重要作用。
 

圖5. 轉錄組中GA、ABA和IAA生物合成、失活和信號轉導途徑相關基因的表達模式。(A)與GA途徑相關的基因表達熱圖。(B)與ABA途徑相關的基因表達熱圖。(C)IAA通路相關基因表達熱圖。從藍色到白色再到紅色的顏色梯度代表基因的低、中、高表達。Log2(FC)的范圍為–1到1。

4.3、類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑的關聯分析（圖6）
依據作者先前的結果，我們在T2和C2的三個途徑中對DEG和DEMs進行了關聯分析（圖6）。我們發現精氨酸和脯氨酸代謝途徑中的部分代謝物與大多數基因顯著相關。此外，在CTK生物合成途徑中，參與黃精細胞分裂素脫氫酶基因(PcCKXs)在三個階段都是活躍的，并與類黃酮、精氨酸和脯氨酸代謝途徑代謝產物顯著相關，其可能也影響黃精種子的休眠解除。
 

圖6. 類黃酮生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝以及玉米素生物合成途徑的相關分析。注：橙色方框代表基因，藍色方框代表代謝物，粉色方框代表PcCKX。紅線表示正相關，藍線表示負相關。

4.4、黃精種子上胚軸休眠解除關鍵時期基因與代謝途徑變化模型分析

作者依據多組學分析結果構建模型（圖7），得到外源6-BA處理促進GA生物合成和信號轉導途徑，并誘導黃精種子上胚軸休眠的釋放。同時，外源6-BA處理可通過抑制PcCKXs的表達，增加上胚軸芽伸長過程中內源性細胞分裂激素的含量。未來的研究將集中于這些關鍵因素在黃精種子休眠解除中的功能作用。
 

圖7. 黃精種子上胚軸休眠解除關鍵時期代謝途徑變化示意圖模型。

結論
已有研究證實外源GA3可以緩解種子休眠，但不能緩解黃精種子的上胚軸休眠。在本研究中，作者探討了外源6-BA處理對黃精種子上胚軸休眠解除的分子機制。結果表明，外源6BA處理能顯著延長上胚軸的芽長，提高黃精種子的出苗率。在黃精種子上胚軸休眠解除過程中，處理組的玉米素、脯氨酸、生長素和赤霉素含量較高，而類黃酮和精氨酸含量較低。PcCKXs與類黃酮生物合成代謝物以及精氨酸和脯氨酸代謝物具有顯著相關性，這些結果為外源6-BA解除黃精種子上胚軸休眠的分子機制提供了新的見解。