鼠尾膠原蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被上的應(yīng)用及三維膠原制備方法
膠原蛋白是結(jié)締組織和內(nèi)臟器官細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)造成分，在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結(jié)構(gòu)上膠原蛋白分為許多類型。
膠原蛋白I（Collagen, Type I）是由2個α1 鏈和1個α2 鏈組成的異源多聚體（圖1），在37℃，中性pH 下自發(fā)形成三螺旋骨架，是一種優(yōu)秀的細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)，廣泛用于肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脊神經(jīng)節(jié)、肌肉細(xì)胞、施萬細(xì)胞、胚肺細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他大量細(xì)胞系。還能用于研究細(xì)胞生長、分化、遷移以及發(fā)育過程中的組織形態(tài)發(fā)生。
圖1 膠原蛋白I分子模型
鼠尾膠原蛋白I 是根據(jù)Birkedal-Hansen 方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)細(xì)胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養(yǎng)器皿表面不易貼壁的細(xì)胞，比如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等原代細(xì)胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實的生長環(huán)境，使得細(xì)胞在三維環(huán)境中生長。
組織培養(yǎng)器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可首選5μg/cm2。建議根據(jù)具體細(xì)胞類型來優(yōu)化。
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mM HAc溶液做進一步稀釋。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml雙蒸水，充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22μm濾膜過濾除菌后待用。
1）根據(jù)自身實驗體系以及優(yōu)化后的包被濃度來計算所需的膠原蛋白量，并加入相應(yīng)孔內(nèi)，確保膠原蛋白溶液完全覆蓋表面。
a. 以包被濃度為 5μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml， 然后參考表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來加量到各孔內(nèi)；
b. 以包被濃度為 2μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如12μg/ml，然后參考表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表來加量到各孔內(nèi)；
表1 不同培養(yǎng)皿內(nèi)膠原蛋白加量表
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培養(yǎng)器皿 |
表面積（cm2,每孔或每皿） |
當(dāng)包被濃度：2ug/cm2，中間稀釋濃度12ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） |
當(dāng)包被濃度：5ug/cm2，中間稀釋濃度50ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） |
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96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 |
0.3 |
50 |
30 |
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24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 |
1.9 |
300 |
190 |
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12孔細(xì)胞培養(yǎng)板 |
3.8 |
600 |
380 |
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6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 |
9.5 |
1580 |
950 |
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35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 |
8 |
1330 |
800 |
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60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 |
21 |
3500 |
2100 |
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100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 |
55 |
9170 |
5500 |
2）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺內(nèi)開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3個月。
當(dāng)鼠尾膠原蛋白I使用濃度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定強度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于6mM HAc的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。
10×細(xì)胞培養(yǎng)液（依據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類而定）、0.1M NaOH、無菌水
1）取200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的離心管內(nèi)，加入690μl無菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入100μl 10×細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。
2）將培養(yǎng)器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。
三維膠原制備（含細(xì)胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：
a. 準(zhǔn)備好細(xì)胞懸液，并放置于冰浴中。b，將200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)】，立即混勻。再加入23μl 10×細(xì)胞培養(yǎng)液，立即混勻【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。再加入760μl 的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。
b. 將培養(yǎng)器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，加入適當(dāng)體積細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
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