文章標題：Multi-omics profifiling visualizes dynamics of cardiac development and functions
發表期刊：Cell Reports
影響因子：9.995
作者單位：南京醫科大學
百趣提供服務：發現代謝組學HD-MIX版

研究背景
哺乳動物的心臟發育是一個多階段且受到嚴格調控的復雜過程，受到多種信號分子和通路在不同時間和空間上的共同精確控制，倘若此過程中的基因調控網絡受到影響將會導致先天性心臟病的發生。因此，系統闡述心臟發育和成熟中的關鍵分子并解析相關疾病發生分子機制尤為重要。然而，目前心臟發育的組學研究大多基于基因的轉錄表達水平，且未有研究通過全生命周期的多組學研究來探討心臟發育和成熟的關鍵因子，阻礙了我們系統地理解心臟發育全過程和心臟出生缺陷發病的病因。

研究方法
為了繪制心臟發育全周期多組學圖譜，南京醫科大學科研團隊基于磷酸化蛋白質組學、蛋白質組學、代謝組學、單細胞轉錄組學等多種組學手段，描繪了心臟發育和成熟進程中關鍵通路和調控因子的分子圖譜和轉換模式。

研究結果
1小鼠心臟的多組學分析

圖1. 心臟發育過程中磷酸蛋白質組、蛋白質組和轉錄組的時間動態

基于轉錄組和蛋白質組的分析發現，超過一半的基因在mRNA和蛋白質水平之間顯示出相對較低的相關性（圖1A和1B）。但隨著時間的推移，相關性逐漸增加最終趨于穩定，結果表明絕對mRNA水平可能不能預測蛋白質豐度。

使用K-means聚類分析將小鼠心臟發育的10個時間點分為4個時期：E10.5–14.5的I期、E16.5–2W的II-III期和4W–8W的IV期（圖1E）。I期基因表達和磷酸化的相關性顯著更高（圖1F），這驗證了磷酸化在早期心臟發育中參與信號強烈。

2心臟發育和成熟的多組推斷和富集途徑

圖2. 心臟發育和成熟過程中三組學的關鍵途徑
 

3 MAPK和AKT通路平衡在調節心臟發育表型轉換中的作用

圖3. 心臟發育過程中信號動力學的表征和關鍵激酶底物的預測
 

蛋白磷酸化是信號轉導和級聯中翻譯后修飾的關鍵。研究人員假設具有相似時間動力學的磷酸化位點更可能是相同激酶的底物，將所有磷酸化位點分為三個主要磷酸肽簇（圖3A、4B）。分別闡述不同簇的特征：簇1的特征是早期顯著激活，隨后磷酸化水平降低，包括MAPK、CDK和CLK3種蛋白激酶（圖3B），并在下游途徑中顯著富集，如蛋白質翻譯、細胞間粘附和蛋白質降解（圖3C）。簇2在II-III階段顯示延遲激活和衰減（圖3B）。除了進一步激活細胞-細胞粘附和切換到激素信號通路之外，簇2中顯著富集通路與簇1中的通路相似（圖3C）。簇3顯示磷酸化水平的穩定增加，表明在心臟發育后期激活（圖3B），該簇磷酸化位點的磷酸蛋白主要富集于心臟的生理和病理過程，包括心肌收縮（圖3C）。

另外，研究團隊采用了iGPS算法（帶相互作用過濾器的GPS算法，或體內GPS），確定了MAPK、CDK和CLK在早期胚胎發育中起著關鍵作用，它們顯著富集了簇1磷酸肽，強調了其在啟動磷酸化信號傳導中的作用。同時還觀察到激酶和底物磷酸化之間的時間一致性（圖3D），這說明了激酶的時間特異性功能。從E10.5到E18.5小鼠心臟，p38 MAPK的總蛋白水平保持不變，而磷酸化（p-）p38 MAPK（180T）的蛋白水平顯著下降，進一步證實了MAPK的磷酸化在心臟發育的早期階段是重要的（圖3E）。然而，磷酸化AKT1（S124）和磷酸化AKT2（S129）的蛋白水平對E14.5中的MAPK產生互斥激活，暗示其對心臟發育的潛在相反影響（圖3D和3E）。

這些結果反映了MAPK和AKT對心臟發育的平衡作用，其中MAPK的磷酸化主要影響心肌細胞的分化，而AKT的磷酸化則主要影響心肌的增殖。

4 識別參與早期心臟發育的核心TFs

圖4. 鑒定調節心臟發育的主轉錄因子的表觀基因組方法

為了進一步探討轉錄因子(Transcription factors, TFs)對哺乳動物心臟發育的重要性，使用表觀組學ATAC-seq技術對E10.5產前小鼠心臟樣本進行了染色質轉座酶可及性測序分析。通過預測轉錄因子結合位點，從而構建TF-TF調控網絡，使用足跡分析來說明該階段的調控詞典（圖4A）。代謝組學分享，將所有TFs分為三組：排名前200名的I級，排名201–400名的II級，其余的III級（圖4B）。在確定的前10個TFs中，多個TFs對小鼠或胚胎干細胞模型中的心臟發育至關重要。

此外，由于更高的時間特異性和對功能性突變的不耐受性也表明了潛在的重要作用，我們評估了I期（E10.5–E14.5）的mRNA表達，以及檢測到的所有TFs的基因對功能喪失（LoF）突變不耐受的概率（pLI評分），結果與上述結論一致（圖4C）。在心臟發育早期高表達且對LoF突變不耐受的TFs中觀察到I級TFs的富集（圖4D）。代謝組學分享，此外，TFRE18的實驗證明了這些TFs的表達和活性，I級組中檢測到的TFs的比例顯著高于II級和III級（圖4E和4F），表明I級TFs在早期心臟發育中的重要作用。

此外，作為最常見的先天性心臟病——法洛四聯癥(TOF)的患者中I級TFs的LoF和有害錯義突變顯著高于正常對照組（圖4G），而II級和III級TFs則沒有。通過足跡分析發現確定的關鍵TFs對心臟發育非常重要，可能是潛在的新型TOF致病基因候選。這些分析揭示了早期心臟發生時基因表達程序的嚴格時間調控，核心TFs對心臟的正常發育至關重要。

同時，為了闡明介導信號級聯的轉錄和染色質調節因子，團隊研究了MAPK底物的共調節因子之間的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)。代謝組學分享，結果表明，基于實驗驗證的STRING數據，富含轉錄調節途徑和I級TF的PPI被認為在早期心臟發育中起關鍵作用。

5 成熟小鼠心臟TCA循環和脂質代謝途徑

圖5. 心臟發育過程中TCA循環和脂質的代謝途徑

基于KEGG富集分析的時間代謝組譜清楚地顯示，在心臟發育過程中，代謝產物的數量發生了顯著變化，主要在TCA循環和心臟的脂質代謝途徑中富集（圖5A和5B）。圖5C質譜中可以看出脂肪酸b氧化(FAO)和TCA循環中的代謝底物被消耗，而關鍵限速酶被高度表達。代謝組學分享，此外，單細胞轉錄譜顯示，成熟CM是參與TCA和FAO代謝的主要細胞亞群，表明這兩種代謝途徑是心肌收縮的主要能量來源（圖5D和5E）。

6 MHC-II+原住型巨噬細胞中花生四烯酸代謝促進傳出細胞增生引起的凋亡細胞吞噬

圖6. 成年小鼠心臟MHC-II+原住型巨噬細胞中花生四烯酸的特異性代謝
 

花生四烯酸(AA)在心臟中也表現出代謝水平的上升（圖5A、5B和6B）。AA合成基因在早期的表達很高，而AA合成基因在成年小鼠心臟中高度表達則表明在后期階段AA基因具有很高的生物活性（圖6A–6C）。

單細胞測序結果表明前列腺素內過氧化物合成酶1（Ptgs1）是將AA轉化為前列腺素E2（PGE2）的限速步驟，在成年小鼠心臟的巨噬細胞中特異性表達（圖6D）。代謝組學分享，根據CCR2的表達和依賴性將巨噬細胞分為三個不同的簇，Ptgs1主要在某些MHC-II+原住型巨噬細胞中表達（圖6E和6F）。橫主動脈收縮(TAC)術后MHC-II+原住型巨噬細胞的Ptgs1+細胞比例顯著增加（圖6G）。這表明Ptgs1通過促進MHC-II+原住型巨噬細胞的成熟而發揮心臟保護作用。有趣的是，在進一步對Ptgs1高表達細胞中的上調基因進行通路分析中發現關鍵傳出細胞受體/酶、CX3C趨化因子受體1（Cx3cr1）和生長抑制特異性6（Gas6）的表達顯著高于MHC-II+/Ptgs1–原住型巨噬細胞（圖6I）。代謝組學分享，上述數據表明，AA及其代謝產物可能通過凋亡細胞的傳出細胞增生在組織修復中發揮潛在作用。

研究結論
該團隊結合磷酸化蛋白質組學和機器學習方法構建磷酸激酶與底物的互作網絡，發現MAPKs和AKTs激酶的平衡激活是心肌細胞分化和增殖能力梯度轉換的關鍵開關；還利用表觀組學ATAC-seq和功能組學TFRE技術系統鑒定了心臟發育早期的核心轉錄因子，類器官及遺傳分析均發現上述核心轉錄因子及其遺傳突變在先天性心臟病的發生中發揮重要作用；最后，作者結合代謝組學和單細胞轉錄組學數據發現花生四烯酸代謝參與心臟MHC-II+原住型巨噬細胞對凋亡心肌細胞的胞葬作用。

該研究為心臟發育和成熟提供了全面的分子描述，顯著豐富了現有的數據集，它們一起揭示了支撐心臟發育和成熟的復雜但協調的分子機制。代謝組學分享，該方法提供了一個通用框架的示例，該框架能夠對不同器官或組織發育的多層次控制進行新的理解，并為驗證致病性突變、告知疾病機制提供功能注釋。