METTL3介導的m6A甲基化譜調控肌肉干細胞成肌細胞狀態轉換
2020年9月29日，《Cell Death Discovery》（IF: 7.109）雜志發表了題為“A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions”的研究論文，研究通過MeRIP-seq（m6A-seq）等實驗鑒定了通過Mettl3在mRNA上的m6A沉積是否是體外和體內肌肉特異性成體干細胞（MuSC）/成肌細胞狀態的調控因子。
標題：A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions（METTL3介導的m6A甲基化譜調控肌肉干細胞成肌細胞狀態轉換）
時間：2020.9.29
期刊：Cell Death Discovery
影響因子：IF 7.109
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、m6A液相色譜/質譜（LC-MS）、RT-PCR等
項目設計
（1）樣本選取：
Cg-Pax7 tm1（Cre / ERT2）Gaka / J小鼠（JAX：017763）與B6N.129S6-Gt（ROSA）26Sor tm1（CAG-tdTomato *，-EGFP）/ Ees / J小鼠雜交（ JAX：005304）產生小樹：Pax7 CreERT2；Rosa26 nTnG（以下稱為Pax7 nTnG）。Pax7 nTnG小鼠用于所有肌肉損傷實驗。普遍表達熒光素酶的小鼠FVB-TG（CAG-luc, -GFP）L2G85Chco / J（JAX：008450, CMV-luc小鼠）被用于分離供體細胞進行移植實驗并被移植到免疫缺陷的NSG小鼠中（NOD. Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ，JAX：005557）。
（2）項目設計流程圖：
研究目的
肌肉特異性成體干細胞(MuSCs)為骨骼肌再生所必需。為確保損傷后骨骼肌的有效再生，MuSCs必須經歷從靜止狀態被激活的狀態轉換，從而產生大量增殖的成肌細胞，并繼續進行終末分化，修復或替換受損的肌纖維，或者自我更新以重新填充靜止的細胞群。MUSC/成肌細胞狀態的變化伴隨著其轉錄譜的顯著動態變化。此前研究已報道鑒定了成體干細胞系統中由m6A writers METTL3介導最豐富的內部mRNA修飾N6-甲基腺苷(m6A)發生了變化，并通過改變這些細胞的轉錄譜來調控細胞狀態轉換。本研究目的是確定通過METTL3的m6A修飾沉積是否在體外和體內對MUSC/成肌細胞狀態轉換起調節作用。研究使用液相色譜/質譜（LC-MS）分析表明在體內骨骼肌再生的早期階段，整體m6A水平增加；在體外C2C12成肌細胞從增殖狀態轉變為分化狀態時，整體m6A水平下降。使用m6A特異性RNA測序（MeRIP-seq）鑒定了m6A修飾的不同圖譜，區分了增殖狀態和分化狀態的C2C12成肌細胞。RNAi研究表明，降低m6A甲基轉移酶METTL3的活性水平可以降低整體m6A水平，并促進C2C12成肌細胞過早分化。在移植前降低原代小鼠MuSC中的METTL3水平可以增強了其在原代移植時的植入能力，但其連續移植能力缺失。總之，本研究證明了METTL3可以調控MuSCs/成肌細胞中的m6A水平，并調控MuSCs/成肌細胞向不同細胞狀態的轉變。此外本研究為增殖和分化C2C12成肌細胞中的m6A修飾提供了第一個轉錄組圖譜，并揭示了可能調控MuSC/成肌細胞狀態轉換的新的基因。
實驗結果
（1）在MuSC從增殖到分化過程中，整體m6A水平下降
圖1：m6A修飾在再生骨骼肌和C2C12成肌細胞中受動態調控
（2）MeRIP-seq揭示了轉錄本特異性m6A修飾豐度的動態變化，但未揭示轉錄本上m6A修飾位點的頻率變化
為了繪制由m6A標記的轉錄組在成肌細胞從增殖轉換到分化時的動態變化，研究在GM和3d DM樣品中進行了MeRIP-seq。MeRIP-seq證實了LC–MS數據，并揭示了在GM（相對于3d DM）樣品中m6A修飾的轉錄本富集。在GM和3d DM樣本中，m6A在轉錄本上的分布相似，最富集在編碼序列和3′區域的邊界區域。因此可以得出結論，m6A富集的整體和轉錄本特異性程序與維持成肌細胞在增殖狀態有關，并且這種作用并非受轉錄本上m6A修飾位點差異驅動。
（3）單個轉錄本水平上的增殖特異性m6A譜的表征
MeRIP-seq分析顯示1607 個m6A peaks代表862個富含GM的特異性基因；通過倍數變化> 1.0（GM / 3d DM）確定RNA-seq數據集中轉錄本表達的增加。MeRIP-seq和RNA-seq數據集之間受影響的分子功能通路的不完全重疊分析表明，GM期間m6A修飾的某些功能結果超出了增強的轉錄本穩定性和/或衰減。
圖2：MeRIP-seq分析將轉錄調控鑒定為C2C12成肌細胞增殖過程中m6A修飾的主要靶點
（4）個體轉錄水平上分化特異性m6A譜的表征
3d DM MeRIP-seq數據集中富集了m6A的轉錄本進行了重復分析，鑒定出573 個m6A peaks與340個特異性基因相關，這些基因在3d DM與GM樣品中顯著富集。PANTHER GO-slim分子功能通路分析顯示，與轉錄調控相關的分子功能通路比GM數據集中的更少。3d DM富集的最主要通路是微管結合（icrotubule binding）。與GM不同的是，MeRIP-seq數據集中鑒定的所有分子功能通路都包含RNA-seq數據集，這表明與GM相比，3d DM中與m6A修飾和轉錄豐度相關性更強。
圖3：MeRIP-seq分析將微管結合鑒定為C2C12成肌細胞分化過程中m6A修飾的主要靶標
（5） Mettl3調控成肌細胞從增殖到分化的過渡
假設由于活性m6A writers Mettl3表達增加，m6A水平在GM樣品中富集。為了模擬再生過程中的MuSC活性，培養C2C12成肌細胞和原代小鼠成肌細胞，然后通過血清限制促使其在體外分化；分化開始后，C2C12成肌細胞（圖4a）和原代小鼠成肌細胞（圖4b）中的Mettl3表達水平顯著下降。
為確定單獨m6A修飾沉積是否足以啟動分化，用靶向Mettl3的siRNA處理C2C12成肌細胞，其成功地降低m6A修飾，而Mettl3敲低會減少細胞計數。還評估了Mettl3敲低對與增殖（Pax7）、早期分化（Myod1）和晚期分化（Myog）相關的MRF影響。Mettl3敲低后Myod1和Myog的基因表達顯著增加，且顯著增加表達eMHC的C2C12成肌細胞數量（eMHC是終末分化標志物），這些數據支持一種模型，在該模型中，增殖的C2C12成肌細胞中的Mettl3敲低可降低m6A修飾的整體水平并導致成肌細胞的過早分化。
圖4：Mettl3敲低促進成肌細胞過早分化
（6）Mettl3基因敲低影響原發性MuSC植入
當在移植前將Mettl3敲低時，移植的MuSC植入和生物發光表達的可能性得到改善。
圖5：Mettl3敲低增強了初次移植后的MuSC植入
參考文獻：
Gheller BJ, Blum JE, Fong EHH, Malysheva OV, Cosgrove BD, Thalacker-Mercer AE. A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions. Cell Death Discov. 2020;6(1):95.
標題：A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions（METTL3介導的m6A甲基化譜調控肌肉干細胞成肌細胞狀態轉換）時間：2020.9.29
期刊：Cell Death Discovery
影響因子：IF 7.109
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、m6A液相色譜/質譜（LC-MS）、RT-PCR等
項目設計
（1）樣本選取：
Cg-Pax7 tm1（Cre / ERT2）Gaka / J小鼠（JAX：017763）與B6N.129S6-Gt（ROSA）26Sor tm1（CAG-tdTomato *，-EGFP）/ Ees / J小鼠雜交（ JAX：005304）產生小樹：Pax7 CreERT2；Rosa26 nTnG（以下稱為Pax7 nTnG）。Pax7 nTnG小鼠用于所有肌肉損傷實驗。普遍表達熒光素酶的小鼠FVB-TG（CAG-luc, -GFP）L2G85Chco / J（JAX：008450, CMV-luc小鼠）被用于分離供體細胞進行移植實驗并被移植到免疫缺陷的NSG小鼠中（NOD. Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ，JAX：005557）。
（2）項目設計流程圖：
研究目的肌肉特異性成體干細胞(MuSCs)為骨骼肌再生所必需。為確保損傷后骨骼肌的有效再生，MuSCs必須經歷從靜止狀態被激活的狀態轉換，從而產生大量增殖的成肌細胞，并繼續進行終末分化，修復或替換受損的肌纖維，或者自我更新以重新填充靜止的細胞群。MUSC/成肌細胞狀態的變化伴隨著其轉錄譜的顯著動態變化。此前研究已報道鑒定了成體干細胞系統中由m6A writers METTL3介導最豐富的內部mRNA修飾N6-甲基腺苷(m6A)發生了變化，并通過改變這些細胞的轉錄譜來調控細胞狀態轉換。本研究目的是確定通過METTL3的m6A修飾沉積是否在體外和體內對MUSC/成肌細胞狀態轉換起調節作用。研究使用液相色譜/質譜（LC-MS）分析表明在體內骨骼肌再生的早期階段，整體m6A水平增加；在體外C2C12成肌細胞從增殖狀態轉變為分化狀態時，整體m6A水平下降。使用m6A特異性RNA測序（MeRIP-seq）鑒定了m6A修飾的不同圖譜，區分了增殖狀態和分化狀態的C2C12成肌細胞。RNAi研究表明，降低m6A甲基轉移酶METTL3的活性水平可以降低整體m6A水平，并促進C2C12成肌細胞過早分化。在移植前降低原代小鼠MuSC中的METTL3水平可以增強了其在原代移植時的植入能力，但其連續移植能力缺失。總之，本研究證明了METTL3可以調控MuSCs/成肌細胞中的m6A水平，并調控MuSCs/成肌細胞向不同細胞狀態的轉變。此外本研究為增殖和分化C2C12成肌細胞中的m6A修飾提供了第一個轉錄組圖譜，并揭示了可能調控MuSC/成肌細胞狀態轉換的新的基因。
實驗結果
（1）在MuSC從增殖到分化過程中，整體m6A水平下降
圖1：m6A修飾在再生骨骼肌和C2C12成肌細胞中受動態調控（2）MeRIP-seq揭示了轉錄本特異性m6A修飾豐度的動態變化，但未揭示轉錄本上m6A修飾位點的頻率變化
為了繪制由m6A標記的轉錄組在成肌細胞從增殖轉換到分化時的動態變化，研究在GM和3d DM樣品中進行了MeRIP-seq。MeRIP-seq證實了LC–MS數據，并揭示了在GM（相對于3d DM）樣品中m6A修飾的轉錄本富集。在GM和3d DM樣本中，m6A在轉錄本上的分布相似，最富集在編碼序列和3′區域的邊界區域。因此可以得出結論，m6A富集的整體和轉錄本特異性程序與維持成肌細胞在增殖狀態有關，并且這種作用并非受轉錄本上m6A修飾位點差異驅動。
（3）單個轉錄本水平上的增殖特異性m6A譜的表征
MeRIP-seq分析顯示1607 個m6A peaks代表862個富含GM的特異性基因；通過倍數變化> 1.0（GM / 3d DM）確定RNA-seq數據集中轉錄本表達的增加。MeRIP-seq和RNA-seq數據集之間受影響的分子功能通路的不完全重疊分析表明，GM期間m6A修飾的某些功能結果超出了增強的轉錄本穩定性和/或衰減。
圖2：MeRIP-seq分析將轉錄調控鑒定為C2C12成肌細胞增殖過程中m6A修飾的主要靶點（4）個體轉錄水平上分化特異性m6A譜的表征
3d DM MeRIP-seq數據集中富集了m6A的轉錄本進行了重復分析，鑒定出573 個m6A peaks與340個特異性基因相關，這些基因在3d DM與GM樣品中顯著富集。PANTHER GO-slim分子功能通路分析顯示，與轉錄調控相關的分子功能通路比GM數據集中的更少。3d DM富集的最主要通路是微管結合（icrotubule binding）。與GM不同的是，MeRIP-seq數據集中鑒定的所有分子功能通路都包含RNA-seq數據集，這表明與GM相比，3d DM中與m6A修飾和轉錄豐度相關性更強。
圖3：MeRIP-seq分析將微管結合鑒定為C2C12成肌細胞分化過程中m6A修飾的主要靶標（5） Mettl3調控成肌細胞從增殖到分化的過渡
假設由于活性m6A writers Mettl3表達增加，m6A水平在GM樣品中富集。為了模擬再生過程中的MuSC活性，培養C2C12成肌細胞和原代小鼠成肌細胞，然后通過血清限制促使其在體外分化；分化開始后，C2C12成肌細胞（圖4a）和原代小鼠成肌細胞（圖4b）中的Mettl3表達水平顯著下降。
為確定單獨m6A修飾沉積是否足以啟動分化，用靶向Mettl3的siRNA處理C2C12成肌細胞，其成功地降低m6A修飾，而Mettl3敲低會減少細胞計數。還評估了Mettl3敲低對與增殖（Pax7）、早期分化（Myod1）和晚期分化（Myog）相關的MRF影響。Mettl3敲低后Myod1和Myog的基因表達顯著增加，且顯著增加表達eMHC的C2C12成肌細胞數量（eMHC是終末分化標志物），這些數據支持一種模型，在該模型中，增殖的C2C12成肌細胞中的Mettl3敲低可降低m6A修飾的整體水平并導致成肌細胞的過早分化。
圖4：Mettl3敲低促進成肌細胞過早分化（6）Mettl3基因敲低影響原發性MuSC植入
當在移植前將Mettl3敲低時，移植的MuSC植入和生物發光表達的可能性得到改善。
圖5：Mettl3敲低增強了初次移植后的MuSC植入參考文獻：
Gheller BJ, Blum JE, Fong EHH, Malysheva OV, Cosgrove BD, Thalacker-Mercer AE. A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions. Cell Death Discov. 2020;6(1):95.
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