細胞培養(yǎng) (Cell culture) 也叫細胞克隆技術(shù)，是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)是細胞和分子生物學(xué)中使用的關(guān)鍵工具，可以對細胞的生理學(xué)和生物化學(xué)進行建模，是生命科學(xué)研究中常用的研究手段。

 

圖 1. 人輸卵管組織原代細胞培養(yǎng)^[1]

   

要想擁有一株健康的細胞，主打 8 個字 “悉心照料，小心呵護”；它就是你實驗生涯中的 “愛寶”。盡管愛護備至，拋開絲滑的無菌操作技術(shù)，污染的因素還是防不勝防：細胞復(fù)蘇過程的水浴，細胞培養(yǎng)箱層，水盤，培養(yǎng)箱柜門，包括各種實驗儀器的蓋子周圍，這些都可能會為污染帶來風(fēng)險。如下圖，不知受何因素污染的細胞和正常的細胞形態(tài)和狀態(tài)有著鮮明的對比。細胞污染的種類一般可分成細菌、真菌，支原體污染等。

 

 
細菌污染是細胞培養(yǎng)中最常見的污染，常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、分歧桿菌以及葡萄球菌污染等。它們的污染肉眼可見：細胞培養(yǎng)基還會隨著細菌負荷的增加，變得渾濁，含有 pH 值指示物 (如中性或酚紅) 的培養(yǎng)液會因細菌污染而酸化 (即變得更黃)。大多細菌在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)桿狀和顆粒狀形態(tài)，并且可以移動，光學(xué)顯微鏡下也可以觀察到，例如下圖細胞培養(yǎng)中分枝桿菌污染導(dǎo)致漂浮的團塊。 

圖 3. 分歧桿菌污染的細胞^[3]

 

 
真菌污染，比如霉菌污染和酵母菌污染等。一般受真菌污染的細胞，培養(yǎng)液是清亮的，但會出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下觀察道細絲狀結(jié)構(gòu)，可看到明顯的菌絲，酵母可能表現(xiàn)為非常小的圓形細胞(單鏈或短鏈)，還可能出現(xiàn)出芽。污染不嚴重的情況下細胞仍可生長，但受污染細胞的活力狀態(tài)明顯變差。

圖 4. 酵母，青霉素等在光學(xué)顯微鏡下的外觀^[3] 

 

 
 
 

MCE 小貼士：

用于細胞培養(yǎng)的器皿和培養(yǎng)液都需要嚴格無菌。若實驗過程中所需的藥物不建議被高溫高壓和輻照殺菌， 建議使用 0.22 μm 的濾膜過濾除菌，可有效避免真菌和細菌污染。

針對細菌污染，在培養(yǎng)基中，加入青霉素-鏈霉素雙抗，慶大霉素，氨芐青霉素或者卡那霉素等抗生素進行處理，可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，從而有效控制細胞污染。預(yù)防霉菌污染可在培養(yǎng)基里加兩性霉素或制霉菌素或放線菌素 D。

但無論是哪種污染， 一旦發(fā)生，很難完全去除細胞中的微生物污染，預(yù)防永遠大于善后！

   

支原體污染可以改變細胞的特性，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致實驗結(jié)論不可靠。支原體是最小的獨立生存生物，不能用可見光顯微鏡進行肉眼檢查，因此可以在細胞培養(yǎng)物中長時間不被發(fā)現(xiàn)。它會誘導(dǎo)細胞參數(shù)的改變 (例如，染色體畸變，代謝和細胞生長的變化)，導(dǎo)致不可靠的實驗結(jié)果 (如下圖紅外顯微鏡下，DBTRG 細胞被支原體感染24小時候的形態(tài)變化)。 

 

 
支原體的污染可以通過專項檢測，例如 PCR 或 DNA 熒光染色來檢測這類污染。
 

 
 
 

MCE 小貼士：

支原體污染細胞后，由于支原體體積很小，無法通過過濾的辦法去除。如果不是極其難得的細胞，建議還是扔了吧。如果還想救一救，需要注意的是支原體沒有細胞壁，因此對作用于細胞壁合成的抗生素是不敏感的。四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對支原體有很好的抑制活性。

支原體清除試劑 BM-Cyclin 有效抑制和清除在細胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，包括口腔支原體 Mycoplasma orale、精氨酸支原體 Mycoplasma arginini、豬鼻支原體 Mycoplasma hyorhinis 等，從而挽救受到污染的珍貴細胞。 

 

介紹完細胞培養(yǎng)常見污染種類之后，大家是不是有了一個初步概念了呢？但是，還有一種情況，從 “照騙” 來看， 妥妥的藥物析出。

   
由于很多小分子水溶性不好，常用有機溶劑，如 DMSO 配制母液，再稀釋到培養(yǎng)基孵育細胞。稀釋的過程中由于產(chǎn)品溶解性、溫度、濃度等因素的影響，很容易出現(xiàn)藥物析出，在顯微鏡下觀察：一般會呈現(xiàn)出針狀，雪花狀或者點狀結(jié)晶。有些童鞋就一不小心誤認為是真菌菌絲了。

   
 
 

MCE 小貼士：

為避免藥物析出，稀釋前，可將母液和培養(yǎng)基 37℃ 預(yù)熱，避免溫度低造成嚴重析出。若稀釋過程中出現(xiàn)化合物析出的情況， 可采用超聲加熱的方法使其復(fù)溶。

 

現(xiàn)在大家是不是能很好的區(qū)分藥物析出和細胞污染及其種類了呢？以后遇到鏡下觀察有 “污染”，不要直接 “棄療”，先判斷一下是否為藥物析出，興許還有救~
 
 

相關(guān)產(chǎn)品

支原體清除試劑 BM-Cyclin 主要成分為延胡索酸泰妙菌素 (Tiamulin fumarate) 和鹽酸米諾環(huán)素 (Minocycline hydrochloride)，可在不影響細胞狀態(tài)的前提下，有效抑制和清除在細胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，對于常見的革蘭氏陰性和陽性菌也有一定的清除作用。

青霉/鏈霉素雙抗溶液 已過濾除菌，可直接用于細胞培養(yǎng)的雙抗溶液。產(chǎn)品添加到細胞培養(yǎng)液中， 可有 效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，從而有效控制細胞污染。青霉素-鏈霉素溶液 (100×) 中，含有青霉素 G 鈉鹽 10 KU/mL，硫酸鏈霉素 10 mg/mL。

兩性霉素 B 無菌溶液 一種多烯類抗真菌抗生素， 破壞真菌正常代謝并引起死亡，從而用于抑制真菌和酵母的污染。

慶大霉素?zé)o菌溶液 慶大霉素通過與細菌核糖 體 30S 亞基結(jié)合阻斷細菌蛋白質(zhì)的合成，可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌和 革蘭氏陰性菌的生長。  細胞培養(yǎng)液中，慶大霉素的推薦工作濃度為 0.5-50 μg/mL。

抗生素-抗真菌素溶液 含青霉素 (10 KU/mL)、鏈霉素 (10 mg/mL)、兩性霉素 B (25 μg/mL)。青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。

潮霉素 B 無菌溶液 氨基糖苷類抗生素，主要通過干擾 70 S 核糖體易位和誘導(dǎo)對 mRNA 模板的錯讀而抑制細胞蛋白質(zhì)的正常合成，從而導(dǎo)致細菌、真菌和哺乳動物細胞死亡。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
 
 

參考文獻

 

 

[1] Fotheringham S, Levanon K, Drapkin R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. 2011 May 9;(51):2728.
 
[2] Selcen Çelik-Uzuner, Uğur Uzuner. An Extensive Method for Maintenance of Sterility in Mammalian Cell Culture Laboratory Routine. Challenges 2017, 8(2), 26  
 
[3] Raymond W Nims, Paul J Price. et al. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants . 2017 Dec;53(10):872-879.   
 
[4] Katia Wehbe , Marzia Vezzalini, Gianfelice Cinque. Detection of mycoplasma in contaminated mammalian cell culture using FTIR microspectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2018 May;410(12):3003-3016.   
 
[5] Cord C Uphoff , Hans G Drexler. Detecting Mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction. Methods Mol Med. 2004;88:319-26. 
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