結膜疾病是一種嚴重影響患者視力的眼表疾病。利用結膜干細胞（CjSC）進行干細胞治療已成為治療結膜疾病的一種很有前途的方法。然而，關于CjSC的培養和微創CjSC移植的研究仍然不足。在這里，利用CELLINK的BIONOVA X 3D生物打印機開發了一種負載CjSC水凝膠微結構 (Hydrogel micro-constructs)。生物打印的水凝膠微構建體可以支持CjSC的活力、干細胞表型和對結膜杯狀細胞的不同分化效力。這些具有可調力學剛性的細胞水凝膠微結構可用于CjSC的擴增動態懸浮培養，或作為一種載體，通過微創結膜下注射將CjSC輸送至球結膜上皮，作為干細胞治療眼病的方法。
關注重點：
1. 3D生物打印的負載細胞微水凝膠載體能支持高細胞活力。
2. 水凝膠載體的力學剛度對細胞活力的直接影響與條件優化。
3. 能維持CjSC的表型和分化潛能。
4. 動態懸浮培養對細胞活力以及細胞增殖和分化潛能的影響。
5. 負載細胞微水凝膠載體的離體結膜下注射 。
       
CELLINK的BIONOVA X 是基于DLP（Digital Light Procession）的3D生物打印專利技術, 能提供一種制造3D構建體的工作流程，該構建體保持高細胞活力，并滿足許多關鍵要求，可轉化為干細胞療法（Fig 1）。BIONOVA X可以在極短的時間內以高分辨率和高通量輕松打印定制的3D幾何圖形（一個結構的時間 30秒）。這樣的過程降低了細胞污染和不必要的暴露的風險，從而導致細胞活力降低。此外，懸浮在水凝膠中的細胞，  BIONOVA X 它允許調整水凝膠力學剛度，這直接影響細胞的活力。另外還能確保細胞保持封裝和固定，最大限度地提高它們對植入的影響。
        這種高通量解決方案可以快速產生多種不同結構與剛性的含細胞微水凝膠載體（直徑100μm，高度100μm）。這種高通量制造，再加上高細胞活力驗證篩選，證明了使用BIONOVA X作為細胞治療開發的可擴展制造方法的巨大潛力。          
細胞外基質（ECM）的力學特征在細胞分化和增殖過程中起著關鍵作用。然而，ECM力學特征對CjSC行為的影響仍不清楚。研究支架剛度和曝光時間之間的關系，以確定封裝CjSC的最佳打印條件。應用四個暴露時間（即15秒、20秒、25秒和30秒）來制造支架。考慮到通常與CjSC相關的體內環境，確定通過20秒的暴露時間可以有利地滿足較軟的硬度。這種較短的曝光時間也確保了減少細胞對光的任何不必要的曝光 (Fig 2)。        
為了用CjSC建立有效的細胞療法，維持干細胞特性至關重要。在這里，我們在CjSC包封的微水凝膠載體上進行了為期6天的培養，研究結果證實3D微水凝膠載體支架是可以長時間維持被包封CjSC的干細胞表型和分化潛能 (Fig 3)。        
要開發一種可臨床轉化的產品，可擴大制造是一個必不可少的要素。動態懸浮培養被認為有利于提高營養物質的吸收、降低成本和提高產量。為了探索細胞增殖的可擴展性和負載細胞的微水凝膠載體作為臨床應用的細胞遞送系統的潛力，對含CjSC微水凝膠進行了動態懸浮培養。其結果證明BIONOVA X打印的3D微水凝膠載體中， 與靜態條件下培養比較，動態懸浮培養的細胞活力更強。同時有效地保持了包埋在微水凝膠中的細胞的增殖和分化能力(Fig 4)。證明了這種擴大生物制造的途徑，以及增加了制造這種基于細胞的療法的可行性。        
微水凝膠載體本身的粘度具有剪切稀化特性。剪切變薄特性對注射過程至關重要，因為它在注射過程中保護包封的細胞免受剪切力的影響，并確保水凝膠載體在移植后保持其保真度并支持其固定。通過臨床使用的30號針頭（內徑~159μm）將載有細胞的水凝膠注射到離體兔眼的球結膜上皮中。驗證3D生物打印的載有細胞的微水凝膠構建體可以作為通過微創注射將CjSC遞送到靶向結膜下區域的良好載體。除了治療眼表疾病外，這種可臨床轉化模型還可以進一步擴展到其他體內細胞治療應用。