m5C甲基化研究揭示mRNA m5C對維持果蠅生殖干細胞發育的分子機制
2020年02月18日，Stower研究所解亭教授團隊與南方科技大學李思思團隊合作研究發現果蠅的YPS蛋白通過優先結合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞的發育。該成果以“Drosophila YBX1 homolog YPS promotes ovarian germ line stem cell development by preferentially recognizing 5-methylcytosine RNAs”為題在線發表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）（IF 11.205）期刊上。
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發現。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調節多種生物學功能，但m5C RNA修飾是否會影響成體干細胞發育尚不清楚。在本研究中，研究人員發現YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過優先結合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發育。YPS和YBX1的保守冷休克結構域（cold-shock domains,CSD）在體外優先與m5C RNA結合。此外，YPS還優先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結合。YBX1 CSD-RNA復合物的晶體結構表明，疏水相互作用和氫鍵對m5C結合至關重要。RNA結合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達會阻礙GSC發育。綜上所述，研究結果表明m5C RNA修飾在成人干細胞發育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉錄組學的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關注。然而，其調控細胞發育和分化機制的機理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標準玉米粉/糖蜜/瓊脂培養基上飼養和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉基因的表達水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結果：
（1）YPS促進果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發現YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細胞顯現出發育延遲，增值變慢的現象，提示該蛋白對于果蠅生殖干細胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結合核酸的保守的cold-shock結構域，研究團隊推測YPS可能通過結合含有甲基化的mRNA來行使功能。
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進果蠅卵巢GSC發育
為了驗證推測，研究團隊首先在YPS缺失的果蠅生殖干細胞中回補表達人源的同類蛋白YBX1，發現YBX1可以替代YPS促進果蠅生殖干細胞正常發育，證明兩個同源蛋白在功能上具有保守性。同時通過Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測序的方法發現YPS確實能在體內結合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA結合
（3）YBX1-CSD主要通過疏水相互作用對帶有m5C修飾的RNA優先結合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結構解析等技術，對比YBX1蛋白結合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復合物結構，發現在YPS和YBX1中高度保守的4個氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對于識別和結合甲基化修飾的RNA至關重要。其中，RNA甲基化增強了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內與甲基化的RNA具有更高親和力。
（4）RNA結合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達嚴重打亂GSC發育
功能實驗證明，當將這些關鍵位點進行缺失突變之后，YBX1無法與RNA結合。不能結合RNA的YPS突變體W65A，F74A以及F85A表現為顯性失活，會打亂果蠅生殖干細胞的發育。結果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對其體內功能至關重要。
易基因小結：
本研究結果表明，YPS通過優先識別帶有m5C修飾的RNA來調節翻譯、剪接和穩定性，從而促進果蠅卵巢中GSC的發育，揭示了其作為mRNA m5C的結合蛋白來影響生殖干細胞發育的分子機制。同時，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細胞中的作用，暗示其可能在人類干細胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細胞發育中的功能，為未來的人類干細胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因對斑馬魚m5C修飾在生理和病理進程中的重要調控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動物mRNA出核和轉錄后調控中發揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測人細胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進行了解讀：m5C RNA甲基化測序技術---從mRNA到全轉錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測，期待更多m5C甲基化修飾功能調控研究成果。
關于m5C甲基化測序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術：
技術優勢：
研究方向：
參考文獻：
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發現。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調節多種生物學功能，但m5C RNA修飾是否會影響成體干細胞發育尚不清楚。在本研究中，研究人員發現YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過優先結合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發育。YPS和YBX1的保守冷休克結構域（cold-shock domains,CSD）在體外優先與m5C RNA結合。此外，YPS還優先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結合。YBX1 CSD-RNA復合物的晶體結構表明，疏水相互作用和氫鍵對m5C結合至關重要。RNA結合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達會阻礙GSC發育。綜上所述，研究結果表明m5C RNA修飾在成人干細胞發育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉錄組學的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關注。然而，其調控細胞發育和分化機制的機理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標準玉米粉/糖蜜/瓊脂培養基上飼養和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉基因的表達水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結果：
（1）YPS促進果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發現YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細胞顯現出發育延遲，增值變慢的現象，提示該蛋白對于果蠅生殖干細胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結合核酸的保守的cold-shock結構域，研究團隊推測YPS可能通過結合含有甲基化的mRNA來行使功能。
圖1：YPS本質上是為了促進GSC維持、增殖和分化
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進果蠅卵巢GSC發育
為了驗證推測，研究團隊首先在YPS缺失的果蠅生殖干細胞中回補表達人源的同類蛋白YBX1，發現YBX1可以替代YPS促進果蠅生殖干細胞正常發育，證明兩個同源蛋白在功能上具有保守性。同時通過Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測序的方法發現YPS確實能在體內結合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA結合
（3）YBX1-CSD主要通過疏水相互作用對帶有m5C修飾的RNA優先結合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結構解析等技術，對比YBX1蛋白結合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復合物結構，發現在YPS和YBX1中高度保守的4個氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對于識別和結合甲基化修飾的RNA至關重要。其中，RNA甲基化增強了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內與甲基化的RNA具有更高親和力。
圖3：果蠅YPS和人YBX1的CSD優先與帶有m5C修飾的RNA結合
（4）RNA結合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達嚴重打亂GSC發育
功能實驗證明，當將這些關鍵位點進行缺失突變之后，YBX1無法與RNA結合。不能結合RNA的YPS突變體W65A，F74A以及F85A表現為顯性失活，會打亂果蠅生殖干細胞的發育。結果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對其體內功能至關重要。
圖4：RNA結合缺失YPS和YBX1突變的種系特異性表達嚴重干擾GSC發育
易基因小結：
本研究結果表明，YPS通過優先識別帶有m5C修飾的RNA來調節翻譯、剪接和穩定性，從而促進果蠅卵巢中GSC的發育，揭示了其作為mRNA m5C的結合蛋白來影響生殖干細胞發育的分子機制。同時，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細胞中的作用，暗示其可能在人類干細胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細胞發育中的功能，為未來的人類干細胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因對斑馬魚m5C修飾在生理和病理進程中的重要調控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動物mRNA出核和轉錄后調控中發揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測人細胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進行了解讀：m5C RNA甲基化測序技術---從mRNA到全轉錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測，期待更多m5C甲基化修飾功能調控研究成果。
關于m5C甲基化測序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術：
- 常規mRNA m5C甲基化測序（RNA-BS）：
- 分離后首先通過亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉變為U，m5C修飾的堿基保持不變，結合高通量測序，可以對RNA上的每一個C堿基修飾進行定位與定量。
- 常規mRNA +lncRNA m5C甲基化測序（lncRNA-BS）：
技術優勢：
- 高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測準確性極高；
- 高通量：結合高通量NGS，全轉錄組范圍內檢測；
- 單堿基：單堿基分辨率，快速檢測和分析RNA中的m5C。
- 高準確：精確的檢測mRNA等每一個C堿基的的修飾水平。
研究方向：
- 與m6A甲基化類似，m5C甲基化已被證明與腫瘤、神經系統紊亂、代謝性疾病、病毒感染以及個體發育等密切相關。
- 此外，RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關，其功能涉及調控干細胞應激、細胞毒性應激、mRNA出核和植物細胞發育及基因表達等方面。
參考文獻：
- doi: 10.1073/pnas.1910862117.
- 南方科技大學：https://science.sustech.edu.cn/portal/Article/index?id=504&cid=10&year=2020&nav_id=95
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