1993 年，科學家 Victor Ambros 等人在研究線蟲時發現了一種名為 LIN-4 的基因，該基因表達一種小 RNA，可以抑制一種核蛋白 LIN-14 基因的表達^[1]。這一小 RNA 就是第一個被報道的 miRNA (見往期推文：小分子和小 RNA 的大大 “夢想”)。此后，成千上萬的 miRNA 在包括人類、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅、水稻、擬南芥等幾乎所有類群中陸續 “浮出水面”……  miRNA 是一種內源性的微小非編碼 RNA，長度一般在 21-23 個核苷酸之間，具有在翻譯水平調控基因表達的功能^[2]。miRNA 的發生 “成長” 需要幾個步驟：最初，miRNA 基因由 RNA 聚合酶 Ⅱ 轉錄，生成較長的前體 pri-miRNA，而后形成發夾狀的 pre-miRNA^[3,4]。最后在細胞質中被切割形成一個成熟的 miRNA 雙鏈。至此，miRNA 從 >1000 個 nt 的 “大可愛” 搖身一變成為了僅約 22 個 nt 的 “小精靈”。成熟的 miRNA 會被裝載到 Argonaute (AGO) 蛋白上，結合形成有活性的 RNA-誘導沉默復合物 (RNA-inducing silencing complex, RISC) 復合體，發揮其多樣的調控功能 (圖 1)^[3]。

miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ 轉錄，生成較長的前體 pri-miRNA，然后與輔助因子 DGCR8 一起被核糖核酸酶 Drosha 切割，從而產生一個發夾狀的 pre-miRNA。隨后，在 Exportin 5-RNA•GTP 復合體介導下，pre-miRNA 從細胞核轉移至細胞質中，并在細胞質中被核酸酶 Dicer 切割掉末端的莖環結構，形成一個成熟的 miRNA 雙鏈。成熟的 miRNA 被裝載到Argonaute(AGO) 蛋白上，結合形成 miRNA-誘導沉默復合物 (miRNA-inducing silencing complex,miRISC)，AGO 蛋白會對 miRNA 兩條鏈進行選擇，5’端熱穩定性較低的 miRNA 引導鏈 (miRNA guide strand) 優先被保留，另一條乘客鏈 (miRNA pass) 則被降解。

在細胞質中介導基因沉默是 miRNA 的 “看家本領”。由于 miRNA 的低互補性， miRNA 常常與靶基因不完全配對，所以，它們可同時調控多個靶基因的表達^[4] (圖 2)。據估計， miRNA  參與了多種關鍵的生物和細胞過程，如凋亡、分化、發育，增殖、代謝及信號轉導通路等，調控人類基因組中多達 30% 的蛋白質編碼基因^[5]。此外，miRNA 失調常與癌癥、糖尿病以及心血管疾病等多種人類疾病相關^[3]。隨著對 miRNA 的深入研究，人們發現 miRNA 能夠以 miRNA 模擬物 (miRNA mimics)、 miRNA 抑制劑 (antimiRs) 或其他形式來靶向在疾病狀態下發生改變的多個 mRNA，用于多種疾病治療 (圖 2)^[3,6]。  

圖 2. 癌癥和其他疾病中的 miRNA^[3] 

 

我們知道，miRNA 參與多種疾病的調控，隨著對 miRNA 的深入探究。研究人員們發現靶向 miRNA 大致有 2 種策略：1. 通過外源性補充 miRNA 以恢復其在疾病環境中的表達; 2. 通過抑制或阻斷 miRNA 來降低 miRNA 的作用 。 

■ 策略一：miRNA 模擬物補充 miRNA

我們知道，miRNA 可通過指導 RISC 在轉錄后水平下調基因的表達，從而實現 mRNA 的降解或翻譯抑制。那么我們就先來說一說 miRNA 模擬物，作為一種合成的外源性雙鏈寡核苷酸，其具有與內源性 miRNA 相同的序列。miRNA 模擬物主要有兩種結合模式：  模式 1：通常情況下，miRNA 成熟后形成 miRISC 復合體，與靶基因 mRNA 的3 '端非編碼區結合，通過 miRNA 的種子序列 (seed region) (5’端第 2-8 位的核苷酸序列)識別并結合靶基因 mRNA 上的特異性結合位點，完全互補匹配的 miRNA 與 AGO2 相互作用，具有核酸酶活性的 RISC 復合體能將靶基因的 mRNA 切割降解，從而抑制靶基因的表達 (圖 3a，左)。模式 2：但大多數動物 miRNA 與 mRNA 的配對是不完美的，存在錯配和凸起結合，miRNA 與靶 mRNA 種子序列部分互補，與 AGO1、3、4 相互作用。這種情況下，便會導致 mRNA 的翻譯過程被抑制^[1] (圖 3a，右)。 

 

 a. miRNA mimics 的兩種結合模式：完全互補的 miRNA 與 AGO2 相互作用 (左)；部分種子匹配的 miRNA 與 AGO1、3、4 相互作用 (右)；miRNA 模擬物引導鏈 (紅色), 乘客鏈 (紫色); 內源性 miRNA 引導鏈 (藍色) 和乘客鏈 (橙色); b. 結合模式導向的靶識別導致靶切割或翻譯抑制和 mRNA 衰變。

 

■ 策略二：阻斷 miRNA 功能

除了補充外源性 miRNA 沉默靶基因外，阻斷 miRNA 功能也是靶向 miRNA 的策略之一。主要是通過 miRNA 抑制劑 (antimiRs)、miRNA “阻斷劑” (blockmirs) 或者 miRNA “海綿” (miRNA sponges) 來降低 miRNA 的表達 (圖 4)。  miRNA 抑制劑一般是指經過化學修飾的短鏈反義寡核苷酸 (antisense oligodeoxynucleotide, ASO)，miRNA 抑制劑直接與成熟 miRNA 完全互補配對，可阻斷 miRNA 和靶基因的結合。

miRNA 阻斷劑與 mRNA 的某些特異性結合位點結合，通過占據結合位點來阻斷正常 miRNA 與靶基因 mRNA 的結合， 但這些 “阻斷劑” 不影響 miRNA 與其他不具有該特異性結合位點的靶基因結合[7]。 

miRNA 海綿通常需要通過病毒載體轉染然后才能轉錄出來。并且 miRNA 海綿同時含有眾多 miRNA 結合位點，可以吸引目標 miRNA 與之配對結合，可作為  miRNA 結合的競爭性抑制劑[7]。

 

 

 

miRNA 抑制劑或 miRNA 海綿可隔離 miRNA 并降低其用于 miRISC 裝載的可用性; 靶位點阻斷劑阻斷 miRNA 與特定靶 mRNA 的結合位點, 導致 mRNA 特異性抑制 miRNA 效應。

■ 實例：miRNA-29b 模擬物抑制腫瘤生長

由于 miRNA 模擬物可模擬內源性 miRNA 的活性，因此，可通過 miRNA 模擬物人為補充外源性 miRNA，增加 miRNA 的總體水平，以恢復相關基因在疾病環境中的表達。例如，在前列腺癌中，miRNA-29b 可靶向沉默 AKT2，從而增加促凋亡基因Bim 的表達，進而抑制腫瘤生長并誘導細胞凋亡 (AKT2 是 miR-29b 的靶點，可抑制促凋亡基因 Bim 的轉錄^[8]）。作者通過轉染 miR-29b-3p 模擬物，增加 PC3 細胞中miR-29b-3p 的表達，結果發現 miR-29b 過表達后，促凋亡基因 BCL2L11 基因 (Bim) 顯著上調 (圖 5a-b)；前列腺癌細胞增殖呈時間依賴性下降，死亡細胞數量顯著增加 (圖 5c-d)；miR-29b 過表達也抑制了前列腺異種移植瘤生長^[9](圖 5e-f)。 

a-b：用 Bim 特異性抗體 Western blot 分析 (a) PC3 細胞的細胞裂解液和 (b) 用 mimic miR-29b 處理的異種移植瘤；c：PC3 細胞轉染對照或模擬 miR-29b, 在 0、24、48、72 h, 用臺盼藍染色細胞，用血細胞計計數活細胞數量。數據以三個獨立實驗的平均值±標準差表示；d: 用 Calcein AM (綠色為活細胞)和 Ethidium homodimer-1 (紅色為死細胞) 染色對照或轉染miR-29b 的 PC3 細胞, 通過熒光顯微鏡定量活細胞和死細胞。箭頭表示死亡細胞。右圖顯示死亡細胞的定量，由五個隨機區域計算; e: 對照和實驗小鼠的代表性腫瘤; f: 每周監測 2 次腫瘤體積，以平均值表示。

 

類似的，miRNA-34a  可通過下調 Bcl-2 和 SIRT1 抑制乳腺癌的增殖和遷移；miR-520 可抑制 Ephrin 信號傳導，從而顯著減少卵巢癌小鼠模型的腫瘤[3]。此外， miRNA 前體也可以增加成熟 miRNA 的水平[10]。不過，也有研究表明 miRNA 模擬物在靶基因抑制中的作用可能依賴于它的濃度以及細胞類型。同時，在不合適的濃度下使用 miRNA 模擬物可能會產生相反的效果[11]。 此外，阻斷 miRNA 的功能同樣會對疾病產生調控作用，據報道 miR-21 可在受損腎臟中放大損傷和纖維化，由于 miR-21 可直接靶向過氧化物酶體增殖劑激活受體 α (Peroxisome proliferator activated receptor-α, PPARα)，從而抑制 PPARα 的轉錄和表達，這破壞了 PPARα 負調活性氧的過程，造成活性氧的積累，最終導致腎細胞凋亡。特異性沉默 miR-21 可以有效逆轉 miR-21 在腎損傷中的有害作用[12]。因此，調控 miRNA 有可能成為一種新的治療策略。

■ 小結

MiRNA 是一種短的單鏈 RNA (約 22 個核苷酸，pre-miRNA 是發夾狀單鏈 RNA)，其可以與 AGO 蛋白結合形成 RISC 復合體，觸發 RNA 干擾，調節靶基因的表達。此外，miRNA 參與了多種關鍵的生物和細胞過程，包括凋亡、分化、發育，增殖、代謝及信號轉導通路等，與多種人類疾病相關，如癌癥、糖尿病以及心血管疾病等。 

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參考文獻

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6. Rupaimoole, Rajesha, et al. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature reviews. Drug discovery vol. 16,3 (2017): 203-222.  
7. Bernardo BC, Ooi JY, et al. miRNA therapeutics: a new class of drugs with potential therapeutic applications in the heart. Future Med Chem. 2015;7(13):1771-1792.  
8. Xie M, Yang A, et al. Akt2 mediates glucocorticoid resistance in lymphoid malignancies through FoxO3a/Bim axis and serves as a direct target for resistance reversal. Cell Death Dis. 2019;9(10):1013. Published 2019 Jan 1.  
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11. Momin MY, Gaddam RR, et al. The Challenges and Opportunities in the Development of MicroRNA Therapeutics: A Multidisciplinary Viewpoint. Cells. 2021;10(11):3097.  
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