高通量測序后的下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法之ChIP-seq介紹
此前，我們分享了染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq）的數(shù)據(jù)挖掘思路，進(jìn)而篩選出TF結(jié)合/組蛋白修飾的目標(biāo)區(qū)域和候選靶基因。
做完ChIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。ChIP-seq的進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)包括以下5個(gè)方面：
1. 簡單驗(yàn)證
2. 轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
3. 靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測其影響下游靶基因的表達(dá)
4. 引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)
5. 超級增強(qiáng)子
一、簡單驗(yàn)證
（1）目標(biāo)基區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/組蛋白修飾的驗(yàn)證：CHIP-qPCR
（2）檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
（3）檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
二、轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
（1）轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾：基因的突變/敲降/敲除/過表達(dá)、相關(guān)蛋白的抑制劑
（2）檢測TF結(jié)合/組蛋白修飾的整體變化：CHIP-seq
（3）檢測目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾的變化：CHIP-qPCR
（4）檢測下游靶基因的mRNA水平：RT-qPCR
（5）檢測下游靶基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
（6）檢測細(xì)胞功能/表型變化
三、靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測其影響下游靶基因的表達(dá)
（1）目的基因結(jié)合/修飾干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase activity assay）、CRISPER-CAS9靶向目標(biāo)區(qū)域引入突變/修飾
（2）檢測目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾變化：CHIP-qPCR
（3）檢測熒光素酶報(bào)告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
（4）檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
（5）檢測細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測定……
四、引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)
top3的motif中，只有MEME-2能夠激活熒光素酶基因表達(dá)，表明FUS1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的是MEME-2 motif
在靶基因3’UTR插入熒光素酶基因，只有FUS1組能夠激活熒光素酶基因的表達(dá)，表明只有FUS1組具有轉(zhuǎn)錄因子活性
引入S486E突變影響到該轉(zhuǎn)錄因子對MEME-2的結(jié)合，也最終影響到靶基因的表達(dá)
五、超級增強(qiáng)子
（1）根據(jù)通用型轉(zhuǎn)錄輔因子Med1在CHIP-seq實(shí)驗(yàn)中富集程度的高低，可以將增強(qiáng)子分為以下兩類:
typical enhancers（TE）：長度為幾百bp
super enhancers（SE）：長度幾千bp
（2）超級增強(qiáng)子的預(yù)測建立在增強(qiáng)子的基礎(chǔ)上，可以看做增強(qiáng)子富集的區(qū)域。
（3）相比增強(qiáng)子，超級增強(qiáng)子區(qū)域具有更高的轉(zhuǎn)錄因子的密度，能夠讓轉(zhuǎn)錄效率提高達(dá)幾百倍。
（4）H3K27ac是活性增強(qiáng)子的標(biāo)志，可以通過H3K27ac CHIP-seq鑒定TE和SE。
CHIP-seq實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵問題
（1）抗體質(zhì)量
ChIP-seq是基于抗體的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，因此它的數(shù)據(jù)質(zhì)量好壞直接取決于抗體的質(zhì)量和特異性。
另外，針對同一蛋白的不同抗體，可能會(huì)識(shí)別不同的表位（尤其是單克隆抗體）。因此建議針對同一感興趣蛋白測試不同的抗體，通過Western blot檢測knock-down前后的差異幫助選擇。
（2）測序數(shù)據(jù)量
為了捕獲所有真實(shí)的結(jié)合位點(diǎn)，而我們看不見摸不著，只能通過測序的reads去計(jì)算來幫助判斷，因此測序reads的數(shù)量是一個(gè)決定因素。
需要多少reads呢？
這個(gè)取決于基因組的大小和感興趣因子的結(jié)合方式（sharp regions for TFs and broad regions for histone marks）。哺乳動(dòng)物中，鑒定TFs至少要滿足10-20M，broad histone marks至少要10-45M，input對照要和ChIP樣本保持同樣測序深度。reads數(shù)量還取決于抗體質(zhì)量和免疫沉淀的效率。信噪比越高，需要的reads數(shù)可以適當(dāng)減少。
（3）生物學(xué)重復(fù)
樣本重復(fù)可以看到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的好壞，選擇相關(guān)性高的樣本進(jìn)行后續(xù)分析
推薦三個(gè)生物重復(fù)，但兩個(gè)現(xiàn)在也能接受（最粗略的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就是：每個(gè)ChIP樣本2個(gè)重復(fù)，input只有一個(gè)沒有重復(fù)）
如果樣本間的本質(zhì)差異越大，越需要設(shè)置重復(fù)，例如從不同人取的樣本。
做完ChIP-seq測序后，如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證，則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。ChIP-seq的進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)包括以下5個(gè)方面：
1. 簡單驗(yàn)證
2. 轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
3. 靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測其影響下游靶基因的表達(dá)
4. 引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)
5. 超級增強(qiáng)子
一、簡單驗(yàn)證
（1）目標(biāo)基區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合/組蛋白修飾的驗(yàn)證：CHIP-qPCR
（2）檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
（3）檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
二、轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾實(shí)驗(yàn)（非靶向），驗(yàn)證是否影響目標(biāo)基因表達(dá)和細(xì)胞功能
（1）轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾添加基因的干擾：基因的突變/敲降/敲除/過表達(dá)、相關(guān)蛋白的抑制劑
（2）檢測TF結(jié)合/組蛋白修飾的整體變化：CHIP-seq
（3）檢測目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾的變化：CHIP-qPCR
（4）檢測下游靶基因的mRNA水平：RT-qPCR
（5）檢測下游靶基因蛋白質(zhì)水平：Western blot
（6）檢測細(xì)胞功能/表型變化
三、靶向目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾干擾實(shí)驗(yàn)，檢測其影響下游靶基因的表達(dá)
（1）目的基因結(jié)合/修飾干擾細(xì)胞系的構(gòu)建：熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase activity assay）、CRISPER-CAS9靶向目標(biāo)區(qū)域引入突變/修飾
· 確定并驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif
· 驗(yàn)證與該motif結(jié)合之后是否能影響靶基因表達(dá)
· 不同區(qū)域引入突變以確定關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)
· 驗(yàn)證與該motif結(jié)合之后是否能影響靶基因表達(dá)
· 不同區(qū)域引入突變以確定關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)
（2）檢測目標(biāo)區(qū)域的TF結(jié)合/組蛋白修飾變化：CHIP-qPCR
（3）檢測熒光素酶報(bào)告基因的mRNA表達(dá)水平：RT-qPCR
（4）檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平：Western blot
（5）檢測細(xì)胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標(biāo)志物測定……
用于驗(yàn)證TF結(jié)合并調(diào)控下游基因的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)
四、引入突變后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的motif，并證明結(jié)合后直接調(diào)控靶基因的表達(dá)
top3的motif中，只有MEME-2能夠激活熒光素酶基因表達(dá)，表明FUS1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的是MEME-2 motif在靶基因3’UTR插入熒光素酶基因，只有FUS1組能夠激活熒光素酶基因的表達(dá)，表明只有FUS1組具有轉(zhuǎn)錄因子活性
引入S486E突變影響到該轉(zhuǎn)錄因子對MEME-2的結(jié)合，也最終影響到靶基因的表達(dá)
五、超級增強(qiáng)子
（1）根據(jù)通用型轉(zhuǎn)錄輔因子Med1在CHIP-seq實(shí)驗(yàn)中富集程度的高低，可以將增強(qiáng)子分為以下兩類:
typical enhancers（TE）：長度為幾百bp
super enhancers（SE）：長度幾千bp
（2）超級增強(qiáng)子的預(yù)測建立在增強(qiáng)子的基礎(chǔ)上，可以看做增強(qiáng)子富集的區(qū)域。
（3）相比增強(qiáng)子，超級增強(qiáng)子區(qū)域具有更高的轉(zhuǎn)錄因子的密度，能夠讓轉(zhuǎn)錄效率提高達(dá)幾百倍。
（4）H3K27ac是活性增強(qiáng)子的標(biāo)志，可以通過H3K27ac CHIP-seq鑒定TE和SE。
CHIP-seq實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵問題
（1）抗體質(zhì)量
ChIP-seq是基于抗體的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，因此它的數(shù)據(jù)質(zhì)量好壞直接取決于抗體的質(zhì)量和特異性。
另外，針對同一蛋白的不同抗體，可能會(huì)識(shí)別不同的表位（尤其是單克隆抗體）。因此建議針對同一感興趣蛋白測試不同的抗體，通過Western blot檢測knock-down前后的差異幫助選擇。
（2）測序數(shù)據(jù)量
為了捕獲所有真實(shí)的結(jié)合位點(diǎn)，而我們看不見摸不著，只能通過測序的reads去計(jì)算來幫助判斷，因此測序reads的數(shù)量是一個(gè)決定因素。
需要多少reads呢？
這個(gè)取決于基因組的大小和感興趣因子的結(jié)合方式（sharp regions for TFs and broad regions for histone marks）。哺乳動(dòng)物中，鑒定TFs至少要滿足10-20M，broad histone marks至少要10-45M，input對照要和ChIP樣本保持同樣測序深度。reads數(shù)量還取決于抗體質(zhì)量和免疫沉淀的效率。信噪比越高，需要的reads數(shù)可以適當(dāng)減少。
（3）生物學(xué)重復(fù)
樣本重復(fù)可以看到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的好壞，選擇相關(guān)性高的樣本進(jìn)行后續(xù)分析
推薦三個(gè)生物重復(fù)，但兩個(gè)現(xiàn)在也能接受（最粗略的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就是：每個(gè)ChIP樣本2個(gè)重復(fù)，input只有一個(gè)沒有重復(fù)）
如果樣本間的本質(zhì)差異越大，越需要設(shè)置重復(fù)，例如從不同人取的樣本。
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ChIP-seq
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